模擬失重對大鼠血漿ghrelin、VIP和胃腸動力的影響

陳 英，楊春敏，韓全利，劉慶森，黃啟陽，郭立國

1.空軍總醫(yī)院干部病房消化內(nèi)科，北京 100142;2.解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科;3.解放軍航天醫(yī)學(xué)工程研究所

模擬失重對大鼠血漿ghrelin、VIP和胃腸動力的影響

陳 英1，楊春敏1，韓全利1，劉慶森2，黃啟陽2，郭立國3

1.空軍總醫(yī)院干部病房消化內(nèi)科，北京 100142;2.解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科;3.解放軍航天醫(yī)學(xué)工程研究所

目的探討模擬失重狀態(tài)下胃腸激素ghrelin和VIP的改變以及對胃腸動力的影響。方法32只Wistar大鼠，隨機分為4組，每組8只，按模擬失重的時程分為14 d組和21 d組，并分別設(shè)立非懸吊14 d對照組和非懸吊21 d對照組。先后進行胃漿膜肌電的描記、葡聚糖藍2000標(biāo)記法測定胃殘留率和小腸推進率，血漿ghrelin和VIP濃度分別用酶免法(ELISA)和放免法(RI)測定。結(jié)果懸吊14 d組與21 d組與相應(yīng)對照組比較，ghrelin濃度下降VIP濃度升高，同時表現(xiàn)為胃肌電延緩，胃殘留率增加;小腸推進率下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論模擬失重狀態(tài)下血漿ghrelin下降和VIP升高可能是導(dǎo)致胃腸動力下降的重要因素之一。

模擬失重;胃腸激素;Ghrelin;VIP;胃腸動力

已有研究表明，模擬失重可引起體液頭向轉(zhuǎn)移從而影響腸道的吸收和運動功能，但具體機制文獻報道很少，而調(diào)節(jié)胃腸動力的胃腸激素在模擬失重狀態(tài)下是否發(fā)生了改變，是大家非常關(guān)注的問題。本研究通過測定血液中影響胃腸動力和食欲的重要胃腸激素ghrelin、VIP的濃度，試圖進一步了解模擬失重對胃腸動力影響的可能機制，為制定消化道功能的保護措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 建立動物模型 尾部懸吊大鼠模型的制備按參考文獻進行［1］。健康雄性10周齡Wistar大鼠32只，體質(zhì)量(350±50)g，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，動物合格證編號:SCXK 2006-0009。在解放軍總醫(yī)院動物中心完成實驗:STF三級動物實驗室，中央空調(diào)恒溫于(23±2)℃，飲用純凈水，保持12 h光照與黑暗交替循環(huán)。動物在懸吊期間，始終保持－30°頭低位及后肢懸垂不荷重的狀態(tài)，每只吊籠(由解放軍總裝備部航天醫(yī)學(xué)工程研究所提供)內(nèi)懸吊1只大鼠，對照組動物也置于同樣鼠籠中，尾部不懸吊，可自由活動，每日攝食量與相應(yīng)懸吊鼠相當(dāng)(4組大鼠飼料成分也相同)。在動物中心內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始制備懸吊模型。實驗動物32只，按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組各8只:非懸吊14 d對照組(CON-14 d);懸吊14 d組(SUS-14 d);非懸吊21 d對照組(CON-21 d);懸吊21d組(SUS-21 d)。

1.2 主要設(shè)備和試劑 GC-911-r放射免疫記數(shù)器(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司);臺式高速低溫離心機(Gen trifuge5415，德國);熒光分光光度儀(RF-530型，日本);低溫冰箱(Forma 952型，美國);分析天平(TG 328型，湘儀天平儀器廠);BL410生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司);ghrelin試劑盒(瑞士BAChem公司);VIP放免試劑盒(北京晶美生物工程有限公司)。酸性正丁醇、正庚烷、OPT溶液、半胱氨酸等(Sigma公司)。葡聚糖藍2000(Blue Dextran 2000，BD 2000，美國 Amersham Pharmacia Biotech 公司)，以蒸餾水配成20 g/L BD2000溶液。高分辨多通道胃腸功能檢測儀(美國Medtronic Synectics公司)。

1.3 胃漿膜肌電的描記 4組大鼠在實驗前禁食12 h，自由飲水，實驗前30 min，依次灌服 BD2000(1 mL/100 g)。然后用10%水合氯醛，按0.2～0.3 mL/100 g分別行腹腔麻醉，開腹暴露胃(統(tǒng)一在幽門近端2 cm處)漿膜下埋置2根鉑金絲電極，連接高分辨多通道胃腸功能檢測儀，以記錄胃漿膜肌電圖，記錄時間為40～50 min/只。記錄指標(biāo)包括:主頻率(DF)、主功率(DP)即振幅、肌電過緩百分率(B%)、肌電過速百分率(T%)、正常肌電節(jié)律百分率(N%)、主頻率變異系數(shù)(DFIC)、主功率變異系數(shù)(DPIC)。其中DFIC即主頻率標(biāo)準(zhǔn)差和平均數(shù)之比，可反映慢波主頻率的細微變化;DPIC即主功率的標(biāo)準(zhǔn)差和平均數(shù)之比，可反映慢波主功率的細微變化。記錄正常對照組大鼠胃肌電DF，并將其定義為大鼠胃正常肌電頻率(3.5～5.5 cpm)。胃肌電節(jié)律失常包括肌電過速(慢波頻率≥5.5 cpm，持續(xù)時間≥1 min);肌電過緩(慢波頻率≤3.5 cpm，持續(xù)時間≥1 min)。

1.4 胃殘留率和小腸推進率的測定 胃肌電圖記錄50 min后依次行股動脈采血后大鼠死亡，每只大鼠留取兩份血樣準(zhǔn)備檢測ghrelin和VIP。取賁門至直腸末端胃腸，自幽門括約肌處取胃，沿大彎剪開，置于裝有蒸餾水2 mL、四氯化碳1.5 mL、無水乙醇0.5 mL的試管中震蕩，使胃內(nèi)殘留色素充分溶解在混合溶液中。3 000 r/min離心30 min，取其上清液用紫外分光光度計于波長620 nm處測定其胃內(nèi)色素殘留量。以對照組的胃內(nèi)色素殘留量為基準(zhǔn)值(100%)，計算胃殘留率:胃殘留率(%)=殘留值/基準(zhǔn)值×100%;分別量取自幽門括約肌至色素最前端及幽門至回盲部的距離，按下列公式計算推進率:推進率(%)=色素在腸內(nèi)推進長度/小腸總長度×100% 。

1.5 血漿ghrelin和血漿VIP的測定 將準(zhǔn)備好的大鼠每只兩份血樣室溫靜置2 h后，3 500 r/min離心20 min，取上清液置－80℃保存待用。ELISA法檢測血漿ghrelin濃度，于酶標(biāo)儀上讀取各孔在450 nm處的吸光度值A(chǔ)450，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用放免法測定VIP的值，取血樣品和不同倍比稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)VIP溶液0.1 mL，均加入抗VIP血清0.1 mL，搖勻后放置4℃冰箱孵育24 h，加PR分離劑0.5 mL后4℃離心，測沉淀cpm值。所有標(biāo)本測定嚴格按照試劑盒說明書進行，由專人操作。

2 結(jié)果

2.1 血漿ghrelin和VIP濃度 分別與對照組比較，SUS-14d和SUS-21d組大鼠血漿ghrelin濃度均明顯下降;而血漿VIP的濃度均明顯升高(見表1)。

表1 大鼠血漿ghrelin和血漿VIP的濃度(n=8，± s)Tab 1 Plasma concentration levels of ghrelin and VIP in rats(n=8，± s)

表1 大鼠血漿ghrelin和血漿VIP的濃度(n=8，± s)Tab 1 Plasma concentration levels of ghrelin and VIP in rats(n=8，± s)

與相應(yīng)對照組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) Ghrelin(pg/mL) VIP(pg/mL)CON-14d 8 0.42 ±0.03 36.77 ±2.12 SUS-14d 8 0.25 ±0.01a 48.87 ±3.50a CON-21d 8 0.40 ±0.02 36.58 ±1.63 SUS-21d 8 0.28 ±0.01a 44.06 ±4.37a

2.2 胃肌電相關(guān)參數(shù) 與相應(yīng)對照組比較，SUS-14 d和SUS-21 d組大鼠胃肌電主頻率明顯降低，振幅也明顯降低，肌電過緩百分比明顯增加(見表2)。DF:dominant frequency主頻率(counts/min CPM);DP:dominant power主功率即振幅(μV);B(%)bradygastria肌電過緩百分比，主頻小于3.5 CPM;N(%)normal正常胃肌電節(jié)律，主頻為(3.5～5.5)CPM;T(%)Tachygastria肌電過速百分比，主頻大于5.5 CPM;DFIC(dominant frequence instability coefficient)主頻變異系數(shù);DPIC(dominant power instability coefficient)主功率變異系數(shù)。

表2 大鼠胃肌電相關(guān)參數(shù)的比較(n=8，± s)Tab 2 The comparison of gastric myoelectricity correlated parameters in rats(n=8，± s)

表2 大鼠胃肌電相關(guān)參數(shù)的比較(n=8，± s)Tab 2 The comparison of gastric myoelectricity correlated parameters in rats(n=8，± s)

與相應(yīng)對照組比較，aP＜0.05

組別 DF(CPM) DP(μV) B(%) N(%) T(%) DFIC(%) DPIC(%)Con-14 d 3.5 ±0.6 764.4 ±1.6 28.21 ±3.4 70.9 ±3.9 1.0 ±0.2 40.7 ±4.6 82.2 ±2.3 SUS-14 d 2.1 ±0.2a 540.6 ±1.5a 45.4 ±3.2a 45.6 ±1.5a 9.0 ±0.4a 76.3 ±5.1a 116.0 ±8.8a Con-21 d 4.5 ±0.3 790.0 ±2.6 15.3 ±2.2 79.7 ±5.4 7.0 ±0.4 16.5 ±0.7 56.8 ±2.9 SUS-21 d 4.2 ±0.4a 730.5 ±3.3a 35.8 ±2.1a 50.0 ±1.4a 14.1 ±0.6a 72.8 ±2.6a 88.5 ±1.9a

2.3 胃殘留率和小腸推進率 分別與對照組比較，SUS-14 d和SUS-21 d組大鼠胃殘留率明顯增加，小腸推進率明顯下降(見表3)。

表3大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較(n=8，± s，%)Tab 3 The comparison of gastric residual rate and intestinal propulsive ratio in rats(n=8，± s，%)

表3大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較(n=8，± s，%)Tab 3 The comparison of gastric residual rate and intestinal propulsive ratio in rats(n=8，± s，%)

與相應(yīng)對照組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 胃殘留率 小腸推進率CON-14 d 8 32.2 ±5.3 78.9 ±5.4 SUS-14 d 8 38.7 ±3.6a 66.3 ±3.8a CON-21 d 8 30.9 ±2.8 79.2 ±2.1 SUS-21 d 8 35.4 ±4.0a 67.5 ±4.7a

3 討論

以往研究表明，模擬失重可以導(dǎo)致腸系膜小靜脈血流阻力減少，循環(huán)血流量增加［2］，腸系膜微循環(huán)發(fā)生障礙，腸黏膜淤血、腫脹［3］，從而引起腸蠕動減弱，結(jié)腸通過時間延長，還可引起腸道菌群失調(diào)，腸上皮細胞腫脹、絨毛排列紊亂、稀疏等改變［4］。除了上述血液循環(huán)因素導(dǎo)致的胃腸動力下降外，是否還存在其他影響因素?ghrelin和VIP是與消化道運動功能密切相關(guān)的兩個胃腸激素，本實驗擬探討二者在模擬失重狀態(tài)下的變化以及與胃腸動力之間的關(guān)系，以便為失重導(dǎo)致的胃腸功能紊亂制定更合理的治療方案。

ghrelin廣泛分布于多種組織器官，包括胃、腸道、胰腺、腎臟、心臟、胎盤、睪丸、下丘腦以及垂體等，其中胃組織中濃度最高，約占全身的20%左右。它是28個氨基酸肽，主要由胃體黏膜組織中X/A樣內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生。ghrelin能與其受體結(jié)合，通過下丘腦弓狀核(ARC)NPY/AgRP神經(jīng)元調(diào)節(jié)胃動力、食欲、體質(zhì)量等［5-6］。ghrelin 能刺激生長激素(GH)的分泌［7］、增進食欲、促進胃排空。Kojima等［8］發(fā)現(xiàn)ghrelin的初始結(jié)構(gòu)、氨基酸序列與胃動素相似，所以ghrelin又被稱為胃動素相關(guān)肽(MTLRP)。ghrelin和胃動素不僅結(jié)構(gòu)相似，而且兩者受體序列有44%一致，在跨膜區(qū)相同序列達到87%，并且均為G蛋白偶聯(lián)受體。ghrelin與胃動素表現(xiàn)出許多相同的作用:刺激食欲、刺激生長激素的釋放、促進胃排空、增強胃動力。

血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)由said等［9］于1970年從豬小腸中分離出來的一種由28個氨基酸組成的直鏈肽，屬胰高血糖素、胰泌素家族。胃腸道VIP的分泌細胞為D1細胞，其廣泛存在于胃腸道黏膜，以結(jié)腸和十二指腸最多。它具有平滑肌松弛和舒血管作用，VIP對胃腸平滑肌起直接抑制作用，可減慢胃排空。并且VIP能抑制胃酸及胃泌素分泌，VIP與胃腸運動主要抑制性介質(zhì)之一的NO關(guān)系密切。VIP能促進NO合成引起環(huán)行肌舒張，NO則能使VIP易于釋放。VIP不僅可抑制胃腸的運動，而且可降低胃腸的緊張。最近有研究揭示，VIP是神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間相互作用的一種信號分子，在局部黏膜炎癥時可促進VIP的產(chǎn)生。

胃排空、腸道推進性運動是胃腸平滑肌在神經(jīng)、體液因素調(diào)節(jié)下電活動與機械活動協(xié)調(diào)的結(jié)果。因而檢測胃漿膜肌電、胃排空、小腸推進性運動可在某種程度上反映胃腸動力狀態(tài)。我們在實驗中記錄胃肌電、測定胃殘留率、小腸推進率，三者共同反映胃腸動力的變化。另外用ELISA法測定血漿ghrelin的濃度;用放免法測定血漿VIP的濃度，并分析這兩種胃腸激素的變化與胃動力變化的關(guān)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬失重可導(dǎo)致ghrelin濃度下降，VIP濃度升高，同時發(fā)現(xiàn)胃肌電頻率降低，胃殘留率增加，小腸推進運動減弱。該結(jié)果表明，模擬失重下，胃腸激素ghrelin的表達減少和VIP表達增多可能是導(dǎo)致胃腸動力下降的重要因素。

分析模擬失重狀態(tài)下ghrelin下降的原因，可能由于ghrelin的表達受迷走神經(jīng)的傳入/傳出支的影響，多項動物實驗表明，ghrelin的信息主要通過迷走神經(jīng)傳入中樞［10-11］而發(fā)揮促進食欲、加強胃動力、增加脂肪含量、增加體質(zhì)量等生物學(xué)效應(yīng)。而在模擬失重狀態(tài)下，機體迷走神經(jīng)反應(yīng)水平普遍降低，勢必使ghrelin的表達下調(diào)。再分析大鼠血漿VIP的濃度升高的原因，根據(jù)以往文獻報道，模擬失重情況下，大鼠門靜脈血內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平均增高，體內(nèi)存在著炎性因子的失衡［12-13］，這一發(fā)現(xiàn)與我們前期的研究結(jié)果是一致的［14］。而消化道在失重過程中的黏膜屏障損傷和局部炎癥反應(yīng)，可以直接或間接促進VIP的釋放，VIP具有促進炎癥修復(fù)的作用［15］，這可能是機體的一種保護性反射。

本研究表明，模擬失重可以導(dǎo)致胃腸激素ghrelin、VIP的變化，這些激素的改變是導(dǎo)致胃腸動力下降的重要因素。隨著尾懸吊時間延長到21 d，血液中g(shù)hrelin濃度和VIP濃度較14 d時有所回調(diào)，推測尾懸吊大鼠胃腸激素的改變可能為可逆性的，或是機體通過自身調(diào)節(jié)逐漸適應(yīng)了模擬失重環(huán)境。因為ghrelin是很重要的促食欲素，推測ghrelin的下降可能也造成了機體食欲的降低?？傊?，胃腸運動受到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸激素等多方面因素的協(xié)調(diào)作用，在模擬失重狀態(tài)下，這些因素的變化和相互之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，更深入的研究還有待繼續(xù)進行。

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The effects of simulated weightlessness on plasma ghrelin，plasma VIP and gastrointestinal motility

CHEN Ying1，YANG Chunmin1，HAN Quanli1，LIU Qingsen2，HUANG Qiyang2，GUO Liguo3
1.Department of Gastroenterology，General Hospital of Air force，PLA，Beijing 100142;2.Department of Gastroenterology，General Hospital of PLA;3.Research Institute of Space Medical-engineering，PLA，China

ObjectiveTo investigate the effects of simulated weightless on the gut hormones(ghrelin and VIP)and gastrointestinal motility.MethodsAccording to the different courses of tail-suspension，thirty two Wistar rats were randomly devided into 4 groups:14-day tail-suspension(SUS-14 d)and 14-day control groups(CON-14 d)，21-day tailsuspension(SUS-21 d)and 21-day control groups(CON-21 d)(n=8/group).Gastromyoelectrical activity of the rat sinus ventriculi was recorded.Then gastric residual rate and intestinal propulsive ratio were measured by BD2000.Plasma concentrations of ghrelin and VIP were determined by an enzymatic spectrophotometric assay and radioimmunoassay respectively.ResultsPlasma concentrations of ghrelin decreased and VIP increased in the SUS-14d and SUS-21 d compared with the control groups.At the same time，gastromyoelectrical activity was delayed，gastric residual rates increased，and intestinal propulsive ratios decreased in the SUS-14 d and SUS-21 d compared with the control groups.The differences were significant(P ＜0.05).ConclusionSimulated weightlessness results in down-regulation of plasma ghrelin and up-regulation of plasma VIP.The changes of these gut hormones are proposed to weaken the gastrointestinal motility in the tail-suspension model rats.

Simulatedweightlessness;Guthormone;Ghrelin;Vasoactiveintestinalpeptide(VIP);Gastrointestinal motility

R852.22

A

1006－5709(2012)01－0055－04

2011-09-05

全軍“十二五”后勤科研重大項目(AKJ11J004)

陳英，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。E-mail:cy20020910@yahoo.com.cn.

楊春敏，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:chunmyang@sina.com