沙眼衣原體主要外膜蛋白多表位免疫血清中和活性分析

陳昊，鞏文詞，陳江，馮娟，呂艷，朱珊麗，陳向敏，薛向陽(yáng)，張麗芳

（溫州醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室、分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035）

沙眼衣原體主要外膜蛋白多表位免疫血清中和活性分析

陳昊，鞏文詞，陳江，馮娟，呂艷，朱珊麗，陳向敏，薛向陽(yáng)，張麗芳

（溫州醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室、分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035）

目的：制備高效價(jià)E型沙眼衣原體（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）168多表位特異性免疫血清并研究其免疫學(xué)特性。方法：純化的Trx-his/CtMOMP168融合蛋白經(jīng)弗氏佐劑乳化后，小鼠背部皮下多點(diǎn)免疫注射，間隔2周后加強(qiáng)免疫，共3次，并分別于免疫前和每次免疫后2周取血，采用ELISA法檢測(cè)血清融合蛋白和E型Ct全菌體特異性抗體水平及變化趨勢(shì)，通過(guò)體外中和反應(yīng)檢測(cè)多表位特異性血清的免疫學(xué)特性。結(jié)果：小鼠用CtMOMP168多表位融合蛋白全程免疫后產(chǎn)生了抗融合蛋白和E型Ct全菌體特異性抗體，ELISA法檢測(cè)最高滴度達(dá)1:500。ELISA和體外中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，該抗體能特異性識(shí)別MOMP多表位蛋白和E型Ct全菌體，并能有效抑制E型Ct感染Hela229細(xì)胞。結(jié)論：沙眼衣原體MOMP多表位融合蛋白免疫血清可特異性結(jié)合并中和E型Ct。

沙眼衣原體；主要外膜蛋白；表位；中和作用

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是性傳播疾病的主要病原體之一，感染普遍，且可增加HIV的感染概率，與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[1-3]，同時(shí)，Ct感染經(jīng)抗生素治療后易復(fù)發(fā)，給Ct的防治帶來(lái)了困難，而疫苗研制是防治Ct感染的主要途徑之一。Ct的主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）占其總外膜蛋白量的60%，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫及包括中和抗體的體液免疫[4]，因而是研究Ct疫苗的主要靶抗原。以抗原表位為基礎(chǔ)的疫苗，可同時(shí)攜帶多個(gè)目標(biāo)抗原以及輔助性表位，通過(guò)B細(xì)胞表位誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，T細(xì)胞表位則誘導(dǎo)CTL效應(yīng)，可達(dá)到同時(shí)誘導(dǎo)特異的體液免疫和細(xì)胞免疫，充分發(fā)揮預(yù)防控制作用的目的。本研究以前期原核表達(dá)的富含多個(gè)CTL、Th和B細(xì)胞表位的E血清型CtMOMP多表位融合蛋白為基礎(chǔ)[4]，免疫小鼠，制備MOMP多表位融合蛋白免疫血清，并對(duì)其結(jié)合E型Ct全菌體的特異性及其中和活性進(jìn)行了鑒定，為Ct感染的診斷和預(yù)防的進(jìn)一步研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康BALB/c小鼠，雌性，5～7周齡，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（浙動(dòng)準(zhǔn)字號(hào)：第22-08660）。

1.1.2 主要質(zhì)粒和試劑：純化的Trx-his/CtMOMP168融合蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存[4]。CtE型菌株購(gòu)自ATCC，編號(hào)為：Trachoma serotype E VR-348B，-80 ℃保存；鼠抗His單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ABR公司；HRP-羊抗鼠IgG（H+L）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司；DAB購(gòu)自索萊寶生物公司；蛋白Marker購(gòu)自Ferments公司；Ni-NTA Agarose購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Trx-his/CtMOMP168融合蛋白的表達(dá)及純化參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 動(dòng)物免疫：選擇純種健康BALB/c小鼠，共分3組，每組9只。實(shí)驗(yàn)前采集小鼠血清，作為陰性對(duì)照。然后分別用制備的Trx-his/CtMOMP多表位融合蛋白、Trx-his-tag蛋白和PBS進(jìn)行免疫。按照0周、2周、4周、6周免疫程序進(jìn)行免疫。首次免疫使用的佐劑為完全弗氏佐劑，第2、3次免疫采用不完全弗氏佐劑，分別與抗原等體積混勻并充分乳化后于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，每只每次注射的Trx-his/CtMOMP多表位融合蛋白或Trxhis-tag蛋白量為50μg。于2周、4周、6周小鼠斷尾取血，第3次免疫后2周摘眼球取血，分離血清，分裝，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定：采用間接ELISA法。包被抗原為5μg/mL的多表位融合蛋白，加入不同時(shí)間段的血清，血清以1:1000倍稀釋，HRP-羊抗鼠IgG（H+L）稀釋度為1:5000。加入顯色液顯色后置Bio Elx 800酶標(biāo)儀于490 nm處讀取吸光度（A）值。所有血清標(biāo)本均做3孔，取平均值。試驗(yàn)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰性及空白對(duì)照。（待測(cè)標(biāo)本A值－空白對(duì)照A值）/（陰性對(duì)照A值－空白對(duì)照A值）≥2.1為陽(yáng)性。免疫血清與E型Ct全菌體的反應(yīng)采用間接ELISA法：包被抗原為經(jīng)適當(dāng)稀釋（105IFU/mL）的純化Ct，血清進(jìn)行倍比稀釋度為1:100、1:500、1:2500、1:12500。余同上。（待測(cè)標(biāo)本A值－空白對(duì)照A值）/（陰性對(duì)照A值－空白對(duì)照A值）≥2.1為陽(yáng)性。陽(yáng)性血清的最高稀釋度即為該血清的抗體效價(jià)。

1.2.4 中和反應(yīng)：體外中和實(shí)驗(yàn)步驟按文獻(xiàn)[5-6]所述。將小鼠血清56 ℃滅活30 min，血清用含5%豚鼠血清（補(bǔ)體）的PBS按1:10、1:40、1:160倍稀釋，104包涵體形成單位（inclusion forming units，IFU）的Ct加入到相應(yīng)的血清稀釋液和對(duì)照中，37 ℃ 孵育45 min，然后將混合物感染Hela229單層細(xì)胞，設(shè)置復(fù)孔，1000 r/min離心1 h，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，加入1 mL含1.5 μg/mL的放線菌酮的DMEM。48 h后甲醇固定，碘液染色，400倍下隨機(jī)計(jì)數(shù)15個(gè)視野，計(jì)數(shù)IFU。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，用student’sttest 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫鼠血清抗體水平ELISA法檢測(cè)結(jié)果 小鼠經(jīng)免疫，約2周后開(kāi)始產(chǎn)生特異性血清抗體，抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而升高，并于第6周達(dá)到A490最大值。CtMOMP168多表位免疫組在0周、2周、4周、6周時(shí)，其抗體ELISA讀數(shù)分別是0.173±0.006、0.261±0.005、0.738±0.027、0.952±0.052，與Trx-his蛋白免疫組（0.163±0.015、0.2611±0.015、0.393±0.048、0.692±0.026）和PBS組（0.144±0.005、0.152±0.005、0.126±0.025、0.166±0.015）比較，在第4周和第6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。

與其他兩組比：*P＜0.05

2.2 免疫鼠血清對(duì)E型Ct全菌體特異性抗體滴度ELISA法檢測(cè)結(jié)果 當(dāng)稀釋度分別為1:100、1:500、1:2 500、1:12 500時(shí)，CtMOMP168多表位組抗體水平分別是：1.100±0.045、0.351±0.014、0.180±0.002、0.155±0.003；Trx-his蛋白免疫組為0.219±0.010、0.191±0.013、0.141±0.002、0.129±0.006；PBS組為0.165±0.016、0.092±0.007、0.089±0.006、0.083±0.001?？贵w效價(jià)為1:500和1:100時(shí)，與Trx-his蛋白免疫組和PBS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖2 ELISA法檢測(cè)免疫鼠血清抗E血清型Ct全菌體抗體的滴度

2.3 體外中和實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果 衣原體血清混合物通過(guò)感染Hela229單層細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置104IFU衣原體與含5%豚鼠血清的PBS混合物為對(duì)照，48 h后，通過(guò)碘染計(jì)數(shù)IFU并計(jì)算各組抑制率。CtMOMP168融合蛋白免疫組在血清稀釋10倍、40倍、160倍時(shí)，其抑制率分別是（0.599±0.068、0.514±0.058、0.325±0.099），與Trx-his蛋白免疫組（0.169±0.059、0.151±0.073、0.091±0.085）和PBS組（0.112±0.078、0.065±0.055、0.026±0.032）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖3）。

圖3 體外中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫鼠血清中和E血清型Ct的感染

3 討論

目前，抗體的制備通常采用動(dòng)物免疫、雜交瘤細(xì)胞技術(shù)等方法。利用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體具備純度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、治療和實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用廣泛。但是單克隆抗體仍然存在僅針對(duì)單個(gè)抗原表位的局限性，且制備技術(shù)要求嚴(yán)格，成本高。利用動(dòng)物免疫制備的多克隆抗體在免疫學(xué)領(lǐng)域同樣有著廣泛的應(yīng)用， 在臨床應(yīng)用中既能用于臨床診斷又能用于疾病治療[7]。與單克隆抗體制備技術(shù)相比，多克隆抗體雖然在特異性、穩(wěn)定性方面不如單克隆抗體，但其制備周期短、工作流程簡(jiǎn)單、成本低、具有多個(gè)與抗原決定簇結(jié)合的位點(diǎn)等特點(diǎn)[8]，使其大量應(yīng)用于免疫學(xué)研究。

Pal等[9]提取MoPn衣原體MOMP與不同的佐劑充分乳化后，肌肉免疫BALB/c和C3H/HeN小鼠，通過(guò)ELISA法檢測(cè)抗體分型發(fā)現(xiàn)，其可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的型特異性MOMP抗體，該抗體可識(shí)別MoPn的原體。Singh等[10]將霍亂毒素偶聯(lián)MOMP后免疫BALB/c小鼠，通過(guò)ELISA法檢測(cè)證明成功誘導(dǎo)出了MOMP特異性抗體。Sun等[11]用原核表達(dá)的重組MOMP蛋白免疫BALB/c小鼠，通過(guò)Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以識(shí)別MoPn原體。Su等[12]則將B細(xì)胞與Th聯(lián)合組成多表位，與弗氏佐劑乳化通過(guò)鼻腔免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血清中IgG抗體與衣原體全菌體及其MOMP均可呈特異性反應(yīng)。本研究以E血清型CtMOMP氨基酸序列為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)在線軟件預(yù)測(cè)并篩選CtMOMP上的多個(gè)CTL表位，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的Th和B細(xì)胞表位，設(shè)計(jì)了富含CTL、Th和B細(xì)胞表位的多表位肽，經(jīng)密碼子優(yōu)化，并通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)制備了CtMOMP多表位蛋白[4]，通過(guò)皮下多點(diǎn)多次免疫BALB/c小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的E型Ct全菌體特異性抗體。

Ct主要通過(guò)黏膜途徑感染機(jī)體，能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有中和作用的抗體，對(duì)預(yù)防Ct病原感染至關(guān)重要[13]，因此中和抗原表位在Ct疫苗的研究方面具有重要意義。本研究通過(guò)小鼠免疫成功獲得了E型CtMOMP多表位蛋白免疫鼠血清，并證明了該免疫血清能夠特異識(shí)別E型Ct，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)能有效地抑制Ct對(duì)Hela229單層細(xì)胞的感染，其抑制率隨抗體效價(jià)的升高而升高，表明其能有效阻止Ct的感染，具有中和活性，為Ct診斷和預(yù)防的進(jìn)一步研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Neutralization activity ofChlamydia trachomatisMOMP multi-epitope protein immune serum

CHEN

Hao，GONG Wenci，CHEN Jiang，F(xiàn)ENG Juan，LV Yan，ZHU Shanli，CHEN Xiangmin，XUE Xiangyang，ZHANG Lifang.
Department of Microbiology & Immunology，Institute of Molecular Virology and Immunology，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To prepare high-titer immune serum specifically against multiepitope fusion protein ofChlamydia trachomatis(Ct)major outer membrane protein(MOMP168)and analyze its immunological characteristics.Methods:BALB/c mice were subcutaneously immunized with the purified Trx-his/CtMOMP168 protein formulated with Freund adjuvant. Three vaccinations were given at 2-week intervals. Sera were taken prior to the first immunization and 2 weeks after each immunization. The specific antibodies to the fusion protein and the whole cell ofCtwere assayed with ELISA. The immunological feature of immunized sera was tested by in vitro neutralization assays.Results:All immunized mice produced high-titer specific antibody to the fusion protein and the whole cell ofCtserotype E after full immunizations. The highest antibody titer was arrived at 1:500. As measured with ELISA and in vitro neutral-ization assays，specific antibodies induced not only perfectly recognized the Trx-his/CtMOMP168 fusion protein and the whole cell ofCtserotype E， but also displayed a significant inhibitory effect on the invasion ofCtserotype E to Hela229 cell.Conclusion:The immune sera against theCtMOMP multi-epitope fusion protein can specifically bindCtof serovar E and show neutralization activity.

Chlamydia trachomatis；major outer membrane protein（MOMP）；epitope；neutralization

R3

A

1000-2138（2012）01-0006-04

2011-03-25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972669）。

陳昊（1985-），男，山東單縣人，碩士生。

張麗芳，教授，博士生導(dǎo)師，Email：zhangli fang08@126.com。

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丁敏嬌）

·論 著·