醋酸鉛對(duì)豚鼠耳蝸橄欖束傳出神經(jīng)毒性的研究

高映勤 馬靜 張鐵松 林建云 林墾 李正才 阮標(biāo)

鉛是廣泛存在于自然界的一種重金屬，隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，鉛隨煙塵、礦塵、污水、廢渣等多種載體進(jìn)入工作區(qū)和生活環(huán)境，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆的損害。近年來(lái)，鉛對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的損害已逐漸引起人們的重視，但其對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損害的確切機(jī)制和部位尚不清楚。內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)正常聽(tīng)覺(jué)發(fā)揮著重要作用，是進(jìn)行音調(diào)定位組合并對(duì)雙耳聲音進(jìn)行整合的場(chǎng)所，其功能在于提高聽(tīng)神經(jīng)閾值，從而能在噪聲環(huán)境中對(duì)足夠的聲信號(hào)源產(chǎn)生反應(yīng)。鉛中毒是否會(huì)導(dǎo)致耳蝸傳出神經(jīng)形態(tài)及功能異常的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用乙酰膽堿酯酶組織化學(xué)染色方法和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)對(duì)側(cè)聲抑制效應(yīng)檢測(cè)，定量分析醋酸鉛對(duì)豚鼠內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)纖維的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 醋酸鉛(上?；瘜W(xué)試劑廠分析純030802)，臨用前將醋酸鉛溶于去離子水，配成濃度為0.25%的溶液；碘代乙酰硫膽堿為英國(guó)SIGMA公司生產(chǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與造模方法 選用健康成年豚鼠70只，雌雄不拘，耳廓反射靈敏，體重250～300 g(昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供)。隨機(jī)分為高鉛組(30只)、低鉛組(30只)和對(duì)照組(10只)。實(shí)驗(yàn)前喂養(yǎng)觀察一周后，高鉛組、低鉛組分別按40 mg/kg和10 mg/kg醋酸鉛腹腔注射，每天1次，連續(xù)1周，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水1 ml，連續(xù)一周。每組分別于停藥后14天和28天各取15只分別行DPOAE對(duì)側(cè)抑制效應(yīng)及血鉛含量檢測(cè)后斷頭處死，進(jìn)行耳蝸基底膜鋪片染色。

1.3DPOAE檢測(cè) 3%戊巴比妥40 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后將豚鼠置于屏蔽室，應(yīng)用ILO92(Nicolet，美國(guó))耳聲發(fā)射儀，將直徑為2 mm的硅膠管制成自制探頭套于與其配套的嬰兒探頭，封閉外耳道口。f2/f1=1.20，初始音強(qiáng)度為L(zhǎng)1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL，疊加次數(shù)80～120次，對(duì)側(cè)均以隨機(jī)順序給以60 dB SPL白噪聲，分別測(cè)試有無(wú)對(duì)側(cè)白噪聲時(shí)的DPOAE幅值，以DPOAE幅值大于本底噪聲3 dB為引出標(biāo)準(zhǔn)，以2 kHz處幅值變化為準(zhǔn)測(cè)出其抑制幅度。

1.4血鉛含量的測(cè)定 采用石墨爐原子吸收法于各時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)各組動(dòng)物血清鉛的含量。

1.5乙酰膽堿酯酶組織化學(xué)染色 暴露耳蝸及卵圓窗、圓窗，去掉鼓膜張肌，開(kāi)放蝸尖，新鮮配置的4%多聚甲醛行耳蝸灌流。固定24小時(shí)后，取出基底膜，浸入0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液30分鐘。將樣品移入新鮮配制的乙酰膽堿酯酶組化反應(yīng)液[含6.5 ml 0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH=6.0)，5 mg碘代乙酰硫膽堿，0.5 ml 0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液，1 ml 30 mmol/L硫酸銅，1 ml 雙蒸餾水和1 ml 5 mmol/L鐵氰化鉀溶液]在室溫下作用30分鐘，用0.1 mol醋酸鹽緩沖液(pH=6.0)漂洗基底膜樣品3次，每次1分鐘；將樣品移入1%硫化銨溶液顯色1分鐘；用0.1 mol/L硝酸鈉溶液漂洗樣品5次，每次1分鐘；將樣品浸入0.1%硝酸銀溶液1分鐘，用0.1 mol/L硝酸鈉溶液漂洗樣品1分鐘后再用0.1 mol/L醋酸緩沖液漂洗1分鐘[1]，將染色好的基底膜按解剖學(xué)位置分回截?cái)?，各回一一放在已滴好甘油的玻片上，蓋片封片，顯微鏡觀察。在網(wǎng)格測(cè)距器下計(jì)數(shù)100 μm基底膜內(nèi)側(cè)耳蝸橄欖束傳出神經(jīng)(media olivocochlear efferent nerve,MOC)纖維平均根數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，組間比較用最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn)，相關(guān)性用相關(guān)分析，方差不齊用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組豚鼠的血鉛含量(表1) 低鉛組和高鉛組的血鉛含量均比正常對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，低鉛組血鉛濃度逐漸下降，而高鉛組血鉛代謝緩慢。染毒動(dòng)物的血鉛含量隨劑量的增高而增加，存在確切的劑量-反應(yīng)關(guān)系(r=0.799，P<0.01)。

2.2醋酸鉛對(duì)豚鼠內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)的影響 乙酰膽堿活性的反應(yīng)產(chǎn)物為亞鐵氰化銅棕黑色沉淀，清晰的定位在傳出神經(jīng)纖維及末梢。對(duì)照組MOC纖維及末梢在耳蝸各回的分布不一致(表1)，鉤回、第一、二回傳出神經(jīng)分布差別不大，第三、第四回傳出神經(jīng)末梢逐漸減少，底回神經(jīng)纖維較粗，而頂回纖維較細(xì)(圖1)。高鉛組停藥2周后，傳出神經(jīng)纖維連續(xù)性中斷，耳蝸乙酰膽堿酯酶終末反應(yīng)物減少，以鉤回、第一回神經(jīng)纖維損傷嚴(yán)重(圖2)，4周后鉤回、第一回僅殘留少量的神經(jīng)末梢(圖3)；低鉛組耳蝸傳出神經(jīng)未見(jiàn)明顯損傷(圖4)。定量分析顯示(表1)：醋酸鉛可對(duì)豚鼠內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆性的損害，鉤回、第一回和停藥后4周傳出神經(jīng)纖維損害最顯著。經(jīng)方差分析，高鉛組MOC纖維平均根數(shù)較低鉛組和對(duì)照組顯著減少，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3DPOAE和對(duì)側(cè)抑制效應(yīng)測(cè)試結(jié)果 對(duì)照組和低鉛組均引出DPOAE，并出現(xiàn)了不同程度的對(duì)側(cè)聲抑制現(xiàn)象，對(duì)照組對(duì)側(cè)聲抑制幅度3.64±1.70 dB，低鉛組停藥后14天和28天分別為3.06±1.19dB和2.86±1.33 dB，與對(duì)照組抑制幅值均值相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高鉛組停藥14天后，15耳中9耳未引出耳聲發(fā)射，另6耳耳聲發(fā)射存在，給予對(duì)側(cè)白噪聲后出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，抑制幅度為0.65～1.38 dB，因多數(shù)無(wú)抑制現(xiàn)象，故其均值為0.74±0.61 dB，與對(duì)照組抑制幅值均值相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高鉛組停藥后28天DPOAE均未引出。

表1 各組豚鼠血鉛含量、傳出神經(jīng)纖維在耳蝸的分布

注：*與對(duì)照組及低鉛組同一時(shí)間比較，P<0.01

圖1 正常耳蝸基底膜鉤回傳出神經(jīng)密度均勻，纖維連續(xù)(×100)圖2 高鉛組用藥2周后鉤回神經(jīng)纖維連續(xù)性中斷，乙酰堿酯酶終末反應(yīng)物減少(×100)圖3 高鉛組用藥4周后鉤回神經(jīng)纖維絕大部分消失(×100)圖4 低鉛組用藥4周后鉤回神經(jīng)纖維均勻，分布清晰(×100)

3 討論

耳蝸橄欖束是將信息由大腦皮質(zhì)或高位聽(tīng)覺(jué)中樞傳至低位聽(tīng)覺(jué)中樞或外周聽(tīng)覺(jué)器官的傳出神經(jīng)束，其胞體位于上橄欖復(fù)合體內(nèi)，其功能在于提高聽(tīng)神經(jīng)閾值，使之對(duì)掩蔽噪聲不太敏感從而能在噪聲環(huán)境中對(duì)足夠的信號(hào)源產(chǎn)生反應(yīng)。聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)對(duì)鉛的毒性較敏感，鉛可對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的影響，但鉛中毒對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損害的確切機(jī)制與部位仍不十分清楚。鉛是一種強(qiáng)神經(jīng)毒物，其神經(jīng)毒性和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)[2]。鉛通過(guò)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞膜的離子代謝、酶的活性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、攝取和儲(chǔ)存及第二信使系統(tǒng)的干擾，影響細(xì)胞和神經(jīng)的代謝活動(dòng)。細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子直接參與調(diào)節(jié)耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，包括去極化、復(fù)極化、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)傳導(dǎo)和頻率調(diào)諧方面起著重要的作用。鉛能競(jìng)爭(zhēng)性阻斷細(xì)胞膜上Ca2+攝取和釋放，使細(xì)胞膜的極性發(fā)生改變，阻止線粒體對(duì)Ca2+的攝取，干擾了細(xì)胞的能量代謝；鉛中毒時(shí)神經(jīng)元?jiǎng)訂TCa2+的能力大幅度提高，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度升高，鈣離子調(diào)節(jié)能力下降使細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能下降，從而引起細(xì)胞內(nèi)一系列的生化過(guò)程[3]。

已有研究發(fā)現(xiàn)染鉛Wistar大鼠的聽(tīng)性腦干反應(yīng)波Ⅰ潛伏期延長(zhǎng)，聽(tīng)功能明顯下降，其原因可能是因?yàn)殂U誘發(fā)組織中脂肪酸構(gòu)成的變化及增加脂質(zhì)過(guò)氧化物引起的聽(tīng)神經(jīng)損害，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)鋅、硒對(duì)鉛的毒性有拮抗作用，可保護(hù)大鼠由于鉛中毒引起的聽(tīng)力損害[4]。研究證實(shí)機(jī)體易感性可能是鉛毒性作用的決定因素，鉛可通過(guò)抑制δ-氨基―γ―酮戊酸脫水酶的活性引起血紅蛋白合成障礙和紅細(xì)胞游離原卟啉增加，而造成間接的聽(tīng)神經(jīng)毒性[5]。

本研究結(jié)果顯示，支配耳蝸外毛細(xì)胞的傳出神經(jīng)纖維在耳蝸的分布密度不一致，耳蝸底回到頂回傳出神經(jīng)支配逐漸減少，越靠?jī)?nèi)排的毛細(xì)胞接收的傳出纖維越多。大劑量鉛中毒時(shí)(高鉛組)耳蝸傳出神經(jīng)纖維受到明顯的損害，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)損害程度呈進(jìn)行性加重，并且以耳蝸鉤回、第一回受損最明顯，逐漸向頂回發(fā)展。小劑量的鉛(低鉛組)對(duì)豚鼠內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸束未產(chǎn)生明顯損害，這可能與傳出神經(jīng)的解剖學(xué)分布有關(guān)，另外，血鉛濃度較低時(shí)鉛可通過(guò)代謝逐漸排出，避免了鉛持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間侵襲神經(jīng)。耳蝸傳出神經(jīng)系統(tǒng)和外毛細(xì)胞形成突觸，近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，鉛可通過(guò)抑制突觸終端的囊泡纖夫蛋白的活性使神經(jīng)遞質(zhì)傳遞失平衡，囊泡纖夫蛋白是第一個(gè)被分離出來(lái)的突觸囊泡整合蛋白，在神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織中均有表達(dá)。鉛可阻礙囊泡纖夫蛋白和突觸前膜列陣蛋白的作用，導(dǎo)致囊泡導(dǎo)向與融合無(wú)法完成，因而干擾了耳蝸傳出神經(jīng)和外毛細(xì)胞間的突觸傳遞[6]。

耳聲發(fā)射已廣泛用來(lái)探討聽(tīng)覺(jué)傳出神經(jīng)系統(tǒng)與耳蝸微機(jī)械活動(dòng)的關(guān)系，利用外毛細(xì)胞受橄欖耳蝸系統(tǒng)激活刺激，可以耳聲發(fā)射對(duì)側(cè)抑制幅度作為評(píng)估聽(tīng)覺(jué)傳出系統(tǒng)功能指標(biāo)，故本研究采用對(duì)側(cè)聲刺激誘發(fā)的DPOAE抑制幅度作為橄欖耳蝸傳出系統(tǒng)功能測(cè)試的方法。文中結(jié)果顯示，對(duì)照組和低鉛組均引出DPOAE并出現(xiàn)了不同程度的對(duì)側(cè)抑制現(xiàn)象，而高鉛組停藥后多數(shù)未引出DPOAE，且少數(shù)耳的對(duì)側(cè)抑制幅度明顯低于低鉛組及對(duì)照組，這與耳蝸傳出神經(jīng)受損的形態(tài)學(xué)相符[7]。楊烽[8]通過(guò)大鼠原代培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)鉛能明顯抑制大鼠皮層神經(jīng)元的存活和突起成長(zhǎng)，隨著鉛濃度的升高其抑制作用逐漸增大，存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。本研究結(jié)果也證實(shí)了血鉛濃度越高，其對(duì)耳蝸傳出神經(jīng)的損傷越重。

鉛對(duì)耳蝸橄欖束的影響很可能是造成聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損害的分子神經(jīng)毒理學(xué)機(jī)制之一。由于耳蝸橄欖束和外毛細(xì)胞形成突觸，并且鉛中毒時(shí)皆可引起損傷，但兩者損害之間是否存在著某種因果關(guān)系，其確切發(fā)生機(jī)制及其損害的關(guān)聯(lián)性仍有待于深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

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