心肌缺血期應(yīng)用環(huán)孢素A對(duì)大鼠心肌功能的影響

劉勇 殷桂林 朱水波 王榮平 孫宗全

[摘要] 目的：通過(guò)大鼠心肌缺血期應(yīng)用線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）抑制劑環(huán)孢素A（CsA），觀察其心肌保護(hù)能力，探討該方式誘導(dǎo)大鼠心肌保護(hù)的可行性。方法：42只健康雄性Wistar大鼠經(jīng)胸骨下段切口暴露心臟，打活結(jié)的方式結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD），建立在體心肌缺血/再灌注損傷模型。①Sham組（n=8）：將縫線穿過(guò)LAD下方，但不結(jié)扎。②缺血/再灌注組（IR組，n=12）：心臟LAD實(shí)施30 min缺血/180 min再灌注處理；③心肌缺血期短暫肢體缺血處理組（RP組，n=12）：心臟LAD實(shí)施30 min缺血/180 min再灌注處理；在實(shí)施心肌缺血期間對(duì)雙下肢實(shí)施3次5 min缺血/5 min再灌注；④環(huán)孢素A組（CS組，n=10）：心臟LAD實(shí)施30 min缺血/180 min再灌注處理；心肌缺血期間經(jīng)心臟測(cè)壓管注射CsA 10 mg/kg。計(jì)算缺血期心律失常（ischemia arrhythmia，IA）及再灌注性心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）評(píng)分；比較左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室壓上升/下降最大速率（±dp/dtmax）；HE染色觀察心肌組織形態(tài)，TTC染色法測(cè)定心肌梗死面積。結(jié)果：CS組與RP組再灌注早期RA評(píng)分均低于IR組（P=0.045、0.023），但CS組與RP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CS組再灌注30、60、120、180 min時(shí)，LVSPmax（P=0.033、0.001、0、0）和再灌注120、180 min時(shí)±dp/dtmax（P=0.046/0.020和P=0.015/0.025）顯著低于IR組。CS組再灌注60、120、180 min時(shí)，LVSPmax（P=0.012、0、0）、再灌注60 min時(shí)-dp/dtmax（P=0.026）及再灌注180 min時(shí)±dp/dtmax顯著低于RP組（P=0.014/0.012）。HE染色發(fā)現(xiàn)CS組存在嚴(yán)重心肌組織水腫。CS組心梗范圍介于RP、IR組之間，RP組心梗范圍顯著小于IR組（P=0.001）、CS組（P=0.043），CS組顯著小于IR組（P=0.026）。結(jié)論：心肌缺血期心腔注射CsA通過(guò)抑制mPTP的開放，減少RA，其效果與RP相當(dāng)，但同時(shí)存在對(duì)心肌的嚴(yán)重副損傷。針對(duì)CsA和心肌mPTP的研究可能對(duì)心肌保護(hù)產(chǎn)生積極影響。

[關(guān)鍵詞] 缺血/再灌注損傷；心肌保護(hù)；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔；環(huán)孢素A；大鼠

[中圖分類號(hào)] R982；R453[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210（2011）11（c）-015-04

Effect on rats′ myocardial function induced by Cyclosporine A during myocardial ischemic period

LIU Yong1, YIN Guilin1, ZHU Shuibo1, WANG Rongping1, SUN Zongquan2

1.Department of Cardiothoracic Surgery, Wuhan General Hospital of Guangzhou military Command, Hubei Province, Wuhan 430070, China; 2.Department of Cardiac Surgery, Union Hospital Affiliate to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Hubei Province, Wuhan 430022, China

[Abstract] Objective: To study the capability of myocardial protection of Cyclosporin A, the inhibitor of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) applied during myocardial ischemic period of rats, and to discuss the feasibility of that method. Methods: Healthy male Wistar rats were administered. The heart was exposed through lower sternal incision and the left anterior descending coronary artery was ligated by slipknot to establish the ischemia/reperfusion model. 42 rats were assigned randomly into four groups. ①Sham group (n=8): rats were threaded a silk suture under the left coronary artery anterior descending (LAD) and laid up throughout the experiment. ②IR group (ischemial reperfusion group) (n=12): rats were subjected to 30 min LAD occlusion followed by 180 min reperfusion. ③RP group (transient limb ischemic conditioning during myocardial ischemia period, remote perconditioning group) (n=12): rats were subjected to three episodes of 5 min double hind limbs occlusion followed by 5 min reperfusion during 30 min myocardial ischemia period which followed by 180 min reperfusion. ④CS group (Cyclosporine A group) (n=10): rats were subjected to 30 min LAD occlusion followed by 180 min reperfusion while CsA was injected into the left ventricle from the catheter dosed with 10 mg/kg. The scores of ischemia arrhythmia and reperfusion arrhythmia, the left ventricular developing pressure, the maximal change index of LV (±dp/dtmax) were calculated. The myocardial morphology was observed by HE staining. Myocardial infarct size was measured by TTC staining technique. Results: RA scores of CS group and RP group were lower significantly than IR group (P=0.045, 0.023), while no significant difference was found compared to RP group. Compared to IR group, LVSPmax was lower significantly at reperfusion time of 30, 60, 120 and 180 min (P=0.033, 0.001, 0, 0); ±dp/dtmax was lower significantly at reperfusion time of 120 and 180 min (P=0.046/0.020 and P=0.015/0.025). Compared to RP group, LVSPmax was lower at reperfusion time of 60, 120 and 180 min (P=0.012, 0, 0); -dp/dtmax at reperfusion time of 60 min and ±dp/dtmax at reperfusion time of 180 min were lower significantly (P=0.026, and P=0.014/0.012). Severe myocardial edema was found in CS group. The infarct size of CS group fell in between RP group and IR group. The infarct size of RP group was significantly smaller than that of IR group (P=0.001) and CS group (P=0.043) while the difference of infarct size between CS and IR group was statistically significant (P=0.026). Conclusion: CsA which injected into heart chamber during myocardial ischemic period can inhibit open of mPTP and reduce RA. The effect is similar to the method of remote conditioning by transient limb ischemia, but it can induce severe side injury. Research aiming at CsA and myocardial mPTP may generate positive impact on myocardial protection.

[Key words] Ischemia/reperfusion injury; Myocardial protection; Mitochondrial permeability transition pore (mPTP); Cyclosporin A; Rats

在大鼠心肌缺血期進(jìn)行短暫雙下肢缺血處理（remote conditioning，RP）可以減少再灌注性心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）[1]、減少心肌梗死。線粒體是心肌細(xì)胞的生死之門，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是非選擇性極高的線粒體內(nèi)膜通道，是心肌細(xì)胞致死性再灌注損傷的決定性因素，也是心肌保護(hù)的最新靶點(diǎn)[2]。通過(guò)大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模型發(fā)現(xiàn)采用預(yù)處理方式應(yīng)用mPTP開放抑制劑環(huán)孢素A（CsA），能夠通過(guò)和線粒體基質(zhì)的親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，CyP-D）結(jié)合抑制mPTP開放，在再灌注過(guò)程中發(fā)揮心肌保護(hù)作用[3]。本實(shí)驗(yàn)采用心肌缺血期應(yīng)用CsA，評(píng)價(jià)其心肌保護(hù)能力，探討心肌缺血期應(yīng)用CsA抑制mPTP開放對(duì)心肌的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

成年健康雄性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量250~410 g，平均（340±59）g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心。水合氯醛為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純；Evan′s Blue及氯化三苯四氮唑（tetrazolium，TTC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CsA購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，250 mg/5 ml，以生理鹽水稀釋為10 mg/ml。嚙齒動(dòng)物人工呼吸機(jī)DH-150，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠；Powerlab 16道生理記錄儀、壓力及生物放大器、1050.1型壓力換能器，澳大利亞AD Instrument公司。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組

大鼠稱重，10％水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，氣管切開，隨后插入16 G套管針（直徑2 mm），連接動(dòng)物人工呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，通氣量3~4 ml/100 g，通氣頻率60次/min，吸呼比1∶1，不需連接輸氧裝置。沿胸骨縱行切開皮膚，沿胸骨正中剪開至第3前肋水平。在左心耳根部下方2~3 mm處以心臟表面左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，用5-0無(wú)創(chuàng)縫合針穿過(guò)心肌表層，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針。結(jié)扎30 min后松結(jié)扎線，持續(xù)觀察180 min建立模型。①Sham組（n=8）：將縫線穿過(guò)左冠脈前降支下方，但不結(jié)扎。②IR組（n=12）：結(jié)扎30 min，再灌180 min。③RP組（n=12）：心臟操作同IR組，在心肌缺血起始時(shí)捆綁雙下肢5 min，以肢體遠(yuǎn)端發(fā)紫，不能觸及股動(dòng)脈搏動(dòng)為準(zhǔn)，松開5 min，反復(fù)3次。④環(huán)孢素A組（CS組，n=10）：心臟操作同IR組，心肌缺血期，經(jīng)心腔測(cè)壓管一次性注入CsA 10 mg/kg[4]。持續(xù)心電監(jiān)測(cè)，經(jīng)心腔測(cè)壓管監(jiān)測(cè)左心室壓力變化[5]。

1.3 標(biāo)本處理

實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)行Evan′s blue染色，Sham組5只，IR組6只、RP組7只、CS組5只進(jìn)行染色處理。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎點(diǎn)原位結(jié)扎，經(jīng)心腔測(cè)壓管注射2%Evan′s blue約為2.5 ml，適當(dāng)夾閉主動(dòng)脈根部，以促進(jìn)Evan′s blue進(jìn)入冠狀動(dòng)脈內(nèi)，待球結(jié)膜藍(lán)染后，心腔注射10%KCl 0.1 ml，使心臟停跳于舒張期，然后切取心臟。冰生理鹽水沖洗后，去除心底大血管，左、右心房及右心室，入-80℃凍存待檢。未行Evan′s blue染色的標(biāo)本取心臟穿線部位與心尖之間的中上2/3的左心室前壁心肌組織以4%甲醛固定，24 h后行常規(guī)石蠟包埋，備用。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 再灌注性心律失常的判斷與評(píng)分觀察記錄心肌缺血期及再灌注期間出現(xiàn)的室性心律失常情況并計(jì)分，評(píng)分參考Curtis等[6]報(bào)道的評(píng)分規(guī)則。具體如下：0分，無(wú)心律失常；1分，偶發(fā)性室性早搏（1 min 內(nèi)發(fā)生3次以下的室性早搏）；2分，頻發(fā)性室性早搏（1 min內(nèi)發(fā)生3次或3 次以上的室性早搏）；3分，偶發(fā)性室性心動(dòng)過(guò)速（1 min內(nèi)發(fā)生3次以下的室性心動(dòng)過(guò)速）；4分，頻發(fā)性室性心動(dòng)過(guò)速（1 min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室性心動(dòng)過(guò)速）或偶發(fā)性室顫（1 min內(nèi)發(fā)生3次以下的室顫）；5分，頻發(fā)性室顫（1 min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室顫）或死亡。

1.4.2 血流動(dòng)力學(xué)變化監(jiān)測(cè)記錄左心室最大收縮壓（LVSPmax），左心室壓力上升/下降最大速率（±dp/dtmax）。

1.4.3 心肌HE染色比較四組各取5個(gè)未進(jìn)行Evan′s blue染色的心臟標(biāo)本，經(jīng)4%甲醛固定后，常規(guī)石臘包埋，制作光鏡切片，觀察心臟組織學(xué)改變。

1.4.4 心肌梗死范圍染色比較取染色心臟標(biāo)本自然升溫到0℃左右時(shí)，從心尖部向心底部橫向切成1~2 mm厚度薄片4~6片，放入1%TTC PBS中（pH=7.40）37℃孵育20 min。用蒸餾水中止反應(yīng)，將切片浸入4%的甲醛中24 h增強(qiáng)顏色對(duì)比。存活心肌呈磚紅色，梗死區(qū)不著色呈灰白色，把心肌片用水沖去多余的染料，并排置于濾紙上吸干水分，放在兩玻片間夾持固定，以固定焦距數(shù)碼相機(jī)拍攝各切片圖象，用Photoshop 8.01軟件分析心肌缺血范圍及心肌梗死范圍。心肌缺血范圍（%）=心肌缺血范圍/心肌片面積之和×100%，心肌梗死面積（%）=（梗死面積之和/心肌缺血范圍）×100%。其中Sham組因無(wú)明顯心肌梗死范圍，不便圖像分析，不進(jìn)行心肌梗死范圍比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)以one-way ANOVA進(jìn)行分析，兩組間按獨(dú)立樣本非參數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心律失常的評(píng)分與比較

缺血期，Sham組受心臟手術(shù)操作干擾，出現(xiàn)少許室性心律失常，以室性早搏為主。其余組均出現(xiàn)室性心律失常，以室性心動(dòng)過(guò)速和室早二、三聯(lián)律為常見，偶見室顫。CS組缺血期心律失常評(píng)分低于IR組及RP組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.099、0.133）。再灌注期，在再灌注前30 min IR組以室性早搏二聯(lián)律及短陣室速為主，RP、CS組以偶發(fā)室性早搏及二聯(lián)律多見。CS組與IR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045）；CS組與RP組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.983）；RP組與IR組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）；隨時(shí)間延長(zhǎng)，心律失常減少至消失，后期各組間評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)的變化情況

各組與Sham組比較發(fā)現(xiàn)，IR組再灌注0 min時(shí)，LVSPmax顯著降低（P=0.004）；再灌注30、60 min-dp/dtmax顯著降低（P=0.015、0.011）。RP組再灌注60 min時(shí)+dp/dtmax顯著降低（P=0.045）。CS組再灌注0~180 min時(shí)，LVSPmax（P=0.040、0.004、0.006、0.001、0）和±dp/dtmax顯著低于Sham組（P=0.045、0.022和P=0.002、0.004）。

CS組與IR組比較發(fā)現(xiàn)，再灌注30、60、120、180 min時(shí)，LVSPmax（P=0.033、0.001、0、0）顯著降低。再灌注120、180 min時(shí)±dp/dtmax（P=0.046、0.020和P=0.015、0.025）顯著降低。

CS組與RP組比較發(fā)現(xiàn)，再灌注60、120、180 min時(shí)，LVSPmax（P=0.012、0、0）顯著降低。再灌注60 min時(shí)-dp/dtmax（P=0.026）、再灌注180 min時(shí)±dp/dtmax低于RP組（P=0.014/0.012）。見表1。

2.3 心肌HE染色比較

Sham組見輕度間質(zhì)出血，心肌略水腫。IR組、RP組均可見心肌組織水腫、間質(zhì)出血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、少數(shù)心肌細(xì)胞變性壞死等。IR心肌全層均有壞死表現(xiàn)，心外膜下心肌水腫，RP組心肌組織的水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變均較IR組有所減輕。CS組除上述表現(xiàn)為還存在嚴(yán)重心肌組織水腫，部分心肌橫紋消失。見圖2。

2.4 心梗范圍的計(jì)算

四組分別有5、6、7、5只大鼠心臟標(biāo)本進(jìn)行心肌缺血范圍及心梗范圍計(jì)算。各組大鼠體重及左室心肌危險(xiǎn)區(qū)域（缺血范圍）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。RP組心梗范圍顯著小于IR組（P=0.001）、CS組（P=0.043），CS組顯著小于IR組（P=0.026），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

3 討論

mPTP開放是心肌IRI的重要機(jī)制之一[7]。免疫抑制劑CsA作為mPTP特異性抑制劑，可以特異性結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)位于線粒體基質(zhì)的結(jié)合蛋白CyP-D，由Ca2+觸發(fā)后與ANT結(jié)合，抑制mPTP的開放。采用CsA預(yù)處理可以抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換的發(fā)生，減輕心臟的再灌注損傷。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血期注射CsA后，與IR組比較，RA評(píng)分顯著降低，心梗范圍顯著減小，但對(duì)心臟舒縮功能的有益作用不顯著。與RP組比較發(fā)現(xiàn)，兩種方式減少RA的作用相當(dāng)，但心肌舒縮功能顯著下降，心梗范圍顯著增大。說(shuō)明CsA在心肌缺血期的應(yīng)用具有一定的心肌保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為可以減少RA的發(fā)生。

RA發(fā)生的根本原因是折返激動(dòng)和觸發(fā)活動(dòng)，其電生理機(jī)制包括再灌流重新形成折返通道，室顫閾值降低，心肌自律性增強(qiáng)等。應(yīng)用CsA具有減少RA的作用，其機(jī)制可能有①M(fèi)g2+向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移抑制了心肌細(xì)胞的鈣超載；②CsA通過(guò)抑制mPTP的開放，減少線粒體內(nèi)Ca2+外流入胞漿，維持胞漿內(nèi)鈣穩(wěn)定，減少了鈣震蕩，減輕RA的發(fā)生。

李揚(yáng)等[8]發(fā)現(xiàn)，給予大鼠5.0、10.0、15.0 mg/kg腹腔注射CsA，隨時(shí)間延長(zhǎng)，各組均可見心肌細(xì)胞、間質(zhì)及周圍血管出現(xiàn)不同程度水腫，胞漿出現(xiàn)嗜酸性變，心肌細(xì)胞有空泡變。部分心肌橫紋消失，有核濃縮、核凝固及心肌小灶狀壞死，嚴(yán)重時(shí)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量CsA對(duì)大鼠心肌組織和心功能無(wú)明顯影響，而較大劑量組大鼠出現(xiàn)不同程度的心肌變性改變和心功能下降，均呈劑量與時(shí)間依賴性。電鏡發(fā)現(xiàn)較大劑量CsA使心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)嵴內(nèi)間隙腫脹甚至嵴斷裂，并因此推測(cè)是CsA使NO大量生成，抵消了CsA作用于mPTP而對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的有益作用。與本實(shí)驗(yàn)中CS組心肌也存在較明顯水腫現(xiàn)象結(jié)果一致。據(jù)此推測(cè)，心腔直接注射CsA，其心臟毒性作用可能更快地作用于心肌細(xì)胞，導(dǎo)致心肌水腫和損害，使心室收縮和舒張功能受損。其機(jī)制可能是CsA持續(xù)抑制Ca2+從肌漿網(wǎng)或線粒體內(nèi)釋放，細(xì)胞器內(nèi)Ca2+超載，線粒體嚴(yán)重?fù)p傷[9]同時(shí)伴有能量轉(zhuǎn)換障礙，ATP減少，Na+-K+泵功能障礙，胞漿內(nèi)Na+、水增多引起心肌水腫。這也可能是本實(shí)驗(yàn)中CsA僅模擬了RP減少RA等作用，而未能改善心肌舒縮功能的主要原因。

綜上所述，心肌缺血期心腔注射CsA通過(guò)抑制mPTP的開放，減少RA，其效果與RP相當(dāng)，但同時(shí)存在對(duì)心肌的嚴(yán)重副損傷。針對(duì)CsA和心肌mPTP的研究可能對(duì)心肌保護(hù)產(chǎn)生積極影響。

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（收稿日期：2011-10-17）