小黃魚蛋白酶水解工藝研究

紀(jì)瑩， 張國(guó)增，， 周素梅

（1.大連民族學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100094）

小黃魚蛋白酶水解工藝研究

紀(jì)瑩1， 張國(guó)增1，2， 周素梅2

（1.大連民族學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100094）

以小黃花魚為原料，以水解度為指標(biāo)，利用蛋白酶解技術(shù)對(duì)小黃魚蛋白進(jìn)行酶解。單酶水解實(shí)驗(yàn)中，選用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，結(jié)果表明，以木瓜蛋白酶酶解小黃魚其水解度最高，故選擇木瓜蛋白酶為最佳酶，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行酶解工藝的研究。小黃魚蛋白酶解工藝研究中，主要研究料液比、酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響。結(jié)果表明，水解度隨加酶量、水解時(shí)間、料液比以及溫度的增加而增加，但在加酶量0.2 mg／d L、水解時(shí)間4 h、料液比1∶3（g∶m L）之前水解度增加速度較快，之后其增加速率明顯減慢；從正交實(shí)驗(yàn)中得到最佳組合為：水解溫度為60℃，水解時(shí)間為4 h，加酶量取0.2，料液比為1∶5（g∶m L）。各因素對(duì)水解度的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋?酶解溫度＞ 加酶量 ＞ 酶解時(shí)間。經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，其水解度最高可達(dá)49.50%。

小黃魚；蛋白質(zhì)；酶解

小黃魚為我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)魚類之一，主要分布在我國(guó)渤海、黃海和東海。其肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)食用魚，也是嬰幼兒及病后體虛者的滋補(bǔ)和食療佳品，但是由于加工方式傳統(tǒng)，小黃魚尚未得到充分開(kāi)發(fā)［1］。以魚肉蛋白為底物，利用控制酶解技術(shù)生產(chǎn)具有生物活性的酶解產(chǎn)物是一個(gè)值得深入研究的領(lǐng)域，。將魚肉蛋白控制酶解后不僅可增大溶解性，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且產(chǎn)生了蛋白質(zhì)所不具備的活性，因此可極大提高淡水魚的附加值［2－6］。

本文主要研究了單酶水解小黃魚的最佳酶解工藝，為提高小黃魚的利用，增加其經(jīng)濟(jì)附加值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)原料：小黃魚，市售；主要試劑：堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶均購(gòu)自丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶購(gòu)自廣西龐博生物科技公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

PHS－3C酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SBH－B型水浴恒溫震蕩搖床：上海豐盟科技材料有限公司；PL203電子秤：梅特勒－托利多電子精密儀器廠；UV－2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LXJ－ⅡB型低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DS－1高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型制造廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理小黃魚，經(jīng)去頭、去皮及內(nèi)臟后將血水和黑膜等清除清洗干凈，取魚肉（去魚刺），分份裝入雙層聚乙烯袋中，置于－20℃冷凍備用。

1.3.2 小黃魚蛋白酶解工藝流程魚肉→（解凍）→破碎→勻漿→魚糜液→90℃下預(yù)處理10 min→冷卻→加堿性蛋白酶的一組調(diào)p H至8.0→加入蛋白酶→酶解→將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶（5 min）→冷卻→離心（4 000 r／min，15 min）→蛋白酶水解液

1.3.3 不同蛋白酶酶解小黃魚蛋白的研究按如上工藝條件，在0.5 mg／d L（以蛋白量計(jì)）加酶量、55℃、料液比1∶4（g∶m L）的條件下，分別選用堿性蛋白酶（Alcalase）、復(fù)合蛋白酶（Protemex）、木瓜蛋白酶（Papin）、風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme）4種蛋白酶對(duì)小黃魚蛋白酶解4小時(shí)，測(cè)定其水解度，從而選取最佳水解單酶。

1.3.4 小黃魚蛋白酶解工藝參數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn)

1）酶濃度對(duì)木瓜蛋白酶酶解的影響 控制固液比1∶4（g∶m L）、酶解時(shí)間為3 h、溫度為55℃、在不同的加酶量（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg／d L）下酶解小黃魚肉蛋白，測(cè)定其水解度。

2）溫度對(duì)小黃魚蛋白酶解的影響 控制料液比為1∶4（g∶m L）、酶解時(shí)間為3 h、加酶量0.5%（mg／d L）、在不同的溫度 （30、40、50 、60 ℃）下酶解小黃魚肉蛋白，測(cè)定其水解度。

3）酶解時(shí)間對(duì)小黃魚蛋白酶解的影響 控制料液比為1∶4（g∶m L）、酶解溫度為55℃、加酶量0.5 mg／d L、在不同的時(shí)間（1、2、4、6、8 h）酶解小黃魚肉蛋白，測(cè)定其水解度。

4）料液比對(duì)小黃魚蛋白酶解的影響 控制酶解溫度為55℃、酶解時(shí)間為3 h、加酶量0.5 mg／d L、在不同的料液比（mg∶d L）（1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8）下酶解小黃魚肉蛋白，測(cè)定其水解度。

1.3.5 優(yōu)化小黃魚蛋白酶解工藝參數(shù)的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇不同酶解因素的適當(dāng)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。以蛋白水解度為指標(biāo)確定最佳酶解條件組合。

1.3.6 水解程度評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的水解度（DH）被定義為，水解斷裂的肽鍵數(shù)占樣品蛋白質(zhì)中的總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)采用TCA法［7］。

蛋白質(zhì)水解度（DH）＝（水解液可溶于10%TCA的氮量／總氮量）＊100%

1.3.7 樣品的總氮質(zhì)量的測(cè)定半自動(dòng)凱氏定氮法［8］。

1.3.8 TCA可溶性氮質(zhì)量的測(cè)定福林－酚法測(cè)定［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適蛋白酶的確定

木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)小黃魚蛋白酶解的水解度均比較高，但以木瓜蛋白酶為最高，而風(fēng)味蛋白酶的水解度明顯很低（見(jiàn)圖1）。因此，選取木瓜蛋白酶為最佳酶解用酶，并以此酶進(jìn)行一下實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究其最佳酶解工藝，以提高水解度。

圖1 不同蛋白酶酶解小黃魚肉蛋白的水解度Fig.1 Effect of protease type on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.2 加酶量對(duì)木瓜蛋白酶水解度的影響

隨著酶用量的增加，水解度也會(huì)隨之會(huì)逐漸增高，但水解度在加酶量小于0.2 g／d L時(shí)會(huì)隨酶量增加而迅速增加，在酶用量高于0.2 g／d L之后，雖然水解度仍在提高，可其增加速度明顯下降（見(jiàn)圖2）。這很可能是由于生成的蛋白酶解物對(duì)酶的抑制或所有可以被酶作用的肽鍵都已與酶結(jié)合，即酶用量已經(jīng)飽和所導(dǎo)致。酶解液中高濃度的可溶性短肽會(huì)使酶解反應(yīng)速率下降［10］。因此，如果在反應(yīng)同時(shí)除去反應(yīng)液中的酶解物，可能會(huì)使酶解反應(yīng)速率和水解度都有所升高，從而提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。

圖2 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme content on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.3 酶解溫度對(duì)木瓜蛋白酶水解度的影響

由圖3可以看出，水解度隨溫度上升，不斷升高。但在50℃～60℃時(shí)其水解度升高程度已變得平緩，根據(jù)生產(chǎn)廠家給出的最佳水解溫度50℃，并考慮到實(shí)際生產(chǎn)中成本及溫度過(guò)高不易控制等因素，故沒(méi)有繼續(xù)更高溫度的實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.4 酶解時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶水解度的影響

隨酶解時(shí)間的增加，料液的水解度逐漸增加，在2～4 h內(nèi)水解度的增加十分顯著，4 h之后其增加程度趨于平緩，水解度增加不大，基本達(dá)到其最大值（見(jiàn)圖4）。其可能有兩方面原因。第一，隨時(shí)間的增加，蛋白逐漸被水解為短肽，酶底物減少，產(chǎn)物增加，這都是降低酶反應(yīng)速率的因素，使水解速度下降；第二，本實(shí)驗(yàn)所用方法是用TCA將大分子蛋白及短肽沉淀后的可溶性蛋白含量，而當(dāng)水解出大量短肽后，可能促使木瓜蛋白酶催化大量短肽進(jìn)一步水解為更短的小肽，此時(shí)的前后兩種短肽都無(wú)法被TCA所沉淀，使得雖然有水解在發(fā)生，但所測(cè)水解度變化不大［11］。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of enzymatic time on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.5 料液比對(duì)木瓜蛋白酶水解度的影響

隨料液比的增加水解度隨之增加，在料液比小于1∶3（g∶m L）時(shí)，隨料液比其水解度增加速度交快，在料液比1∶3（g∶m L）之后，水解度增加速度十分緩慢。其原因可能是液固比較小時(shí)，也許底物濃度過(guò)高，分散不均勻，過(guò)多底物分子堆集于酶的活動(dòng)中心，從而會(huì)影響酶催化速度及產(chǎn)物分子的擴(kuò)散，故水解度較低；液固比過(guò)大的話，一方面雖然使底物分散更均勻，溶解度增加，但同時(shí)酶的濃度下降，勢(shì)必對(duì)蛋白水解造成不利影響［12］。

圖5 料液比對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of the ratio of small yellow croaker fish to water on the hydrolysis of small yellow croaker fish protein

2.6 優(yōu)化小黃魚蛋白酶解工藝條件的正交實(shí)驗(yàn)

為了得到較準(zhǔn)確的工藝條件及參數(shù)，對(duì)加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比4個(gè)主要因素，以水解度為指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)酶解小黃魚蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)安排見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 木瓜蛋白酶的正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and level of orthogonal experiment

表2 木瓜蛋白酶酶解條件正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Tab.2 Results of orthgonal experiment

續(xù)表2

對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果采用極差分析的方法比較各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小。根據(jù)表3中計(jì)算的極差的大小可以看出，各因素對(duì)水解度影響的主次順序?yàn)椋毫弦罕龋久附鉁囟龋久赣昧浚久附鈺r(shí)間，可知料液比對(duì)木瓜蛋白酶酶解小黃魚蛋白水解度的影響最大，而酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響則很小。并可得出最適水解條件為A3B1C3D3，即水解溫度為60℃，水解時(shí)間為4 h，加酶量取0.2 mg／d L，料液比為1∶5（g∶m L），其水解度可達(dá)49.50%。

表3 木瓜蛋白酶酶解條件正交實(shí)驗(yàn)極差分析Tab.3 Range analysis of the orthogonal experiment

3 結(jié)語(yǔ)

本文以小黃花魚為原料，以水解度為指標(biāo)，利用蛋白酶解技術(shù)對(duì)小黃魚蛋白進(jìn)行酶解，研究結(jié)果如下：

1）以水解度為選酶指標(biāo)，選用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶對(duì)小黃魚魚肉進(jìn)行酶法水解，結(jié)果表明酶解效果木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶水解度都較高，但其中以木瓜蛋白酶水解度最高，風(fēng)味蛋白酶最差。故采用木瓜蛋白酶作為酶解用最佳單酶，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其最佳水解工藝。

2）在單因素實(shí)驗(yàn)中可以看出，水解度隨加酶量、水解時(shí)間、料液比以及30～60℃范圍內(nèi)溫度的增加而增加，但在加酶量0.2 mg／d L、水解時(shí)間4h、料液比1∶3（g∶m L）之前水解度增加速度較快，之后其增加速率明顯減慢。

3）從正交實(shí)驗(yàn)中得到最佳組合為：水解溫度為60℃，水解時(shí)間為3 h，加酶量取0.4 mg／d L，料液比為1∶5（g∶m L）。各因素對(duì)水解度的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋久附鉁囟龋炯用噶浚久附鈺r(shí)間。經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，其水解度可達(dá)49.50%。

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Hydrolyzing of Small Yellow Croaker Fish Protein

JI Ying1，ZHANG Guo－zeng1，2，ZHOU Su－mei2

（1.College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China；2.Institute of Agro－Products Processing Science and Technology Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100094，China）

In order to take full advantage of pseudosciaena polyactis and increase their added value，the hydrolyzing of small yellow croaker fish protein were studied in this manuscript.The enzymatic hydrolysis of protein in small yellow croaker fish by alcalase，flavourzyme，papain and protemex were firstly studied and papain was selected for further study with the degree of hydrolysis（DH）as index.Then the effect of papain on the the degree of hydrolysis（DH）was investigated by single factor test and orthogonal experiment.The results of the single factor test showed that DH increases with the amount of enzyme，hydrolysis time，the ratio of small yellow croaker fish to water and the temperature and the optimum conditions listed as follows：0.2 mg／d L enzyme，reaction time 4 h，the ratio of small yellow croaker fish to water 1∶3.Furthermore，the optimum conditions was determined by the orthogonal experiment，and listed as follows：the amount 0.4 mg／d L，hydrolyzed for 4h at 60℃and the ratio of mall yellow croaker fish to water at the ratio of 1∶5.The effect those factors on DH was the ratio of small yellow croaker fish to water＞temperature＞amount of enzyme＞time.

small yellow croaker，protein，enzymatic hydrolysis

紀(jì)瑩（1980－），女，吉林通化人，工學(xué)博士，講師，主要從事功能性食品及品質(zhì)改良研究。E－mail：yingji＠dlnu.edu.cn

S 37

A

1673－1689（2012）05－0555－05

2010－10－28