植物乳桿菌K25的技術(shù)特性

王 輯， 張 雪， 李 達， 張卓丹， 侯聚敏， 牛春華， 楊貞耐＊，，

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130018；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130033；3.吉林大學 軍需科技學院，吉林 長春 130062；4.吉林大學 生物與農(nóng)業(yè)工程學院，吉林 長春 130025）

植物乳桿菌K25的技術(shù)特性

王 輯1，2， 張 雪2， 李 達2， 張卓丹3， 侯聚敏4， 牛春華2， 楊貞耐＊1，2，3，4

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130018；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130033；3.吉林大學 軍需科技學院，吉林 長春 130062；4.吉林大學 生物與農(nóng)業(yè)工程學院，吉林 長春 130025）

對西藏靈菇來源的一株益生性植物乳桿菌K25進行技術(shù)特性研究。結(jié)果表明，植物乳桿菌K25的凝乳活性較弱，蛋白質(zhì)水解活性一般，自溶活性較高；該菌株對志賀氏菌的抑制作用較強，而對兩株酸奶發(fā)酵劑菌株無抑制作用；藥敏試驗表明，該菌株對紅霉素高度敏感；丙酸鈣對植物乳桿菌K25的生長無顯著影響；該菌株在發(fā)酵乳冷藏期間，表現(xiàn)出較好的存活能力，并且不會造成發(fā)酵乳后酸化。

益生菌；植物乳桿菌；技術(shù)特性；附屬發(fā)酵劑

近年來，歐美及日本一些學者對益生菌的大量研究表明，益生菌在抗變異原性、防癌抗癌和增強機體免疫力方面有著不可低估的作用［1］。將益生菌作為附屬發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳制品中，不僅可以增加發(fā)酵乳制品的保健功效，而且還可以改善其品質(zhì)，賦予其獨特的風味［2］，深受消費者的青睞。目前國內(nèi)外投入市場的益生菌發(fā)酵乳制品種類很多，如酸奶和奶酪，它們是最適宜的益生菌載體［3］。然而大多數(shù)益生菌在發(fā)酵乳制品貨架期內(nèi)的存活能力較差，為了合理開發(fā)應(yīng)用益生菌產(chǎn)品，對益生菌技術(shù)特性進行研究是至關(guān)重要的。

作者所選用的菌株K25是從西藏靈菇中分離得到的，經(jīng)表型、生理生化及API鑒定，確定該菌株為植物乳桿菌。經(jīng)體外、體內(nèi)試驗表明，該菌株具有較好的調(diào)節(jié)血脂以及抗氧化功效。為了驗證該菌株是否可作為附屬菌添加到發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中，對其技術(shù)特性進行了研究，包括菌株的凝乳活性、蛋白水解活性、自溶活性、抑菌活性、抗生素藥敏試驗、抑菌劑對其影響以及菌種在冷藏期間存活能力等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株植物乳桿菌K25：由作者所在實驗室從西藏靈菇中分離得到；嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌：作者所在試驗室保藏菌株，分離自丹尼斯克公司YO－MIX直投發(fā)酵劑；鼠李糖乳桿菌LGG：作者所在試驗室保藏；致病菌：購自廣東微生物種質(zhì)資源庫。

1.1.2 培養(yǎng)基MRS瓊脂培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g／L，牛肉膏10.0 g／L，酵母粉5.0 g／L，葡萄糖20.0 g／L，吐溫80 1.0 g／L，磷酸氫二鉀2.0 g／L，乙酸鈉5.0 g／L，檸檬酸鈉5.0 g／L，硫酸鎂0.2 g／L，硫酸錳0.054 g／L，蒸餾水1 000 m L，1 mol／L乙酸調(diào)p H為6.5，121℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑脫脂乳粉：新西蘭進口；酪氨酸：北京鼎國生物技術(shù)有限公司；山梨酸鉀：國醫(yī)集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機Sorvall Evolution RC：美國Thermo Electron公司；PB－10數(shù)顯 pH 計：德國Sartorius公司；紫外可見分光光度計（Cary300）：美國Varian公司。

1.3 植物乳桿菌K25凝乳活性試驗

配制10 g／d L脫脂乳（RSM），含0.25 g／d L酵母粉的10 g／d L脫脂乳（RSM－YE），0.25 g／d L水解酪蛋白的10 g／d L脫脂乳（RSM－CH），0.25 g／d L蛋白胨的10 g／d L脫脂乳（RSM－P），1 g／d L葡萄糖的10 g／d L脫脂乳（RSM－G）。植物乳桿菌K25按體積分數(shù)2%接種于各脫脂乳中，于42℃培養(yǎng)16 h后，觀察是否凝乳［4］。

1.4 植物乳桿菌K25蛋白水解活性測定

采用改進的Church等（1983）的鄰苯二甲醛（OPA）方法繪制酪氨酸標準曲線［5］，見圖1。

圖1 OPA法酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine by OPA method

將活化好的植物乳桿菌K25按體積分數(shù)1%接種于10 g／d L的脫脂乳中，在37℃下培養(yǎng)24 h，采用未接菌的10 g／d L的脫脂乳作為空白。準確吸取2.5 m L樣品，置于試管中，加入0.5 m L重蒸餾水混勻，然后加入0.5 m L、0.75 mol／L的三氯乙酸（TCA），經(jīng)旋渦混合儀混勻，于室溫下靜置10 min后，3 000 r／min，4℃離心5 min，取上清液備用。上清液1 m L加入試管中，再加入3 m L的OPA試劑，混勻后，在室溫下反應(yīng)2 min，于340 nm處測定吸光度。對應(yīng)標準曲線得出蛋白質(zhì)水解活性相當于酪氨酸的量，A340作為OPA指數(shù)也可直接用于對比［6］。選取一株由作者所在試驗室保藏的鼠李糖乳桿菌LGG作為對照。

1.5 植物乳桿菌K25自溶活性測定

將植物乳桿菌K25按體積分數(shù)1%接種到MRS液體培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的菌液（OD600為0.7～0.8），經(jīng)10 000g、4℃離心10 min，收集菌泥。然后用磷酸鹽緩沖液（p H 6.8）洗滌兩次后懸浮，于37℃下放置48 h。分別于第3、6、9、24、48 h取樣，在600 nm處測定其吸光度。自溶活性以菌液在600 nm處的吸光度減少量來表示。

1.6 植物乳桿菌K25抑菌活性測定

采用改進的 Hechard等［7］（1990）的瓊脂平板擴散法。選取4株常見的致病菌：金黃色葡萄球菌CMCC26071、大腸桿菌CMCC44825、福氏志賀氏菌CMCC51061、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115以及2株發(fā)酵劑菌株嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，分別接種到適宜的瓊脂培養(yǎng)基上，無菌條件下放置5 h。待瓊脂板凝固后用直徑為8 mm的牛津杯在瓊脂培養(yǎng)基上打孔。將活化好的植物乳桿菌K25菌液，經(jīng)10 000g、4℃離心10 min，收集上清液備用。為了排除過氧化氫以及乳酸的干擾，上清液應(yīng)經(jīng)微孔濾膜過濾后再調(diào)p H 6.0，同時添加無菌的過氧化氫酶（1 000 U／m L）。取處理過的上清液50μL加入到瓊脂板上的孔中，然后放到適宜條件下培養(yǎng)48 h。用直尺測量抑菌圈的直徑。抑菌效果按以下標準評定：當無抑菌圈時，代表無抑制作用（－）；當抑菌圈直徑在0～3 mm之間，代表抑菌效果弱（＋）；當抑菌圈直徑在3～6 mm之間，代表抑菌效果良好（＋＋）；當抑菌圈直徑大于6 mm，代表抑菌效果強（＋＋＋）［8］。

1.7 植物乳桿菌K25抗生素藥敏試驗

采用改進的Charteris等［9］（1998）的方法。選用10種抗生素：青霉素、氯霉素、赤霉素、紅霉素、硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素、頭孢噻肟和利福平。將活化好的植物乳桿菌K25按體積分數(shù)1%接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)期（106～107cfu／m L）。取200 μL菌液到MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，無菌條件下室溫放置1 h。待平板凝固后將抗生素藥敏紙片放至平板上，37℃培養(yǎng)24 h。抗生素的藥敏性參照WHO提供的NCCLS最新版本的標準進行。

1.8 抑菌劑對植物乳桿菌K25生長的影響試驗

選用乳制品生產(chǎn)中常用的3種抑菌劑：氯化鈉、山梨酸鉀和丙酸鈣。配制含不同濃度抑菌劑的液體MRS培養(yǎng)基，然后將植物乳桿菌K25按體積分數(shù)3%接種到各培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，于590 nm處測定吸光度，以不添加抑菌劑的液體MRS培養(yǎng)基為空白。植物乳桿菌K25的相對增長率以占空白培養(yǎng)基吸光度的百分比表示。

1.9 植物乳桿菌K25在冷藏期間存活能力及發(fā)酵乳p H值變化測定

將活化好的菌種按107cfu／m L的接種量接種到10 g／d L脫脂乳中，于37℃發(fā)酵20 h后，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中冷藏28 d。采用MRS瓊脂培養(yǎng)基（p H 6.6）平板計數(shù)法，測定發(fā)酵乳在4℃冷藏期間第1、7、14、21、28天的活菌數(shù)。同時，測定冷藏期間發(fā)酵乳的p H值。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌K25凝乳活性

乳酸菌發(fā)酵時能利用牛乳中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，導致牛乳的p H值逐漸降低，達到酪蛋白的等電點時，酪蛋白聚集沉降，從而形成半固體狀態(tài)的凝膠物質(zhì)，即凝乳現(xiàn)象。一般把在16 h之內(nèi)能凝乳的乳酸菌定義為快速凝乳菌株。目前，工業(yè)上最常用的乳酸菌有嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌等。

作者對植物乳桿菌K25在脫脂乳以及補充氮源或碳源的脫脂乳中的凝乳特性進行了分析，結(jié)果見表1。植物乳桿菌K25在16 h之內(nèi)，并沒有使脫脂乳產(chǎn)生凝乳，而添加了0.25 g／d L酵母粉的脫脂乳產(chǎn)生了凝乳，可見植物乳桿菌K25不屬于快速凝乳 菌。Nieto－Arribas 等［10］（2009）對 10 株 從Manchego奶酪中分離得到的植物乳桿菌進行了凝乳活性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分植物乳桿菌的凝乳活性較差。此外，Medina等［11］（2001）的研究也驗證了這一結(jié)論。雖然植物乳桿菌的凝乳活性較差，但作為附屬菌，可以不參與發(fā)酵乳的產(chǎn)酸過程，而在益生性方面發(fā)揮其獨特的優(yōu)勢。

表1 植物乳桿菌K25凝乳特性試驗Tab.1 Milk coagulation activity of L.plantarum K25

2.2 植物乳桿菌K25蛋白水解活性測定

乳酸菌能將牛乳中的蛋白質(zhì)吸收分解成肽和氨基酸，使其變得易于消化、吸收。作者采用的OPA方法是一種迅速、敏感、方便的測定牛乳蛋白水解的方法。通過與鄰苯二甲醛和β－巰基乙醇的水解反應(yīng)，α－氨基酸被釋放出來，并形成在340 nm有強吸收的混合物。

由圖2可以看出，植物乳桿菌K25對乳蛋白水解活性與對照組LGG相似。隨著發(fā)酵時間的延長，植物乳桿菌K25的A340在4～8 h有急速下降的過程，8～16 h之間保持平穩(wěn)，在第20小時達到最低，隨后有所增長，24 h時的吸光度值為0.227 3，對應(yīng)游離氨基酸質(zhì)量濃度為25.6μg／m L，與對照組LGG在24 h后的對應(yīng)的游離氨基酸質(zhì)量濃度相比差異不顯著 （P＞0.05）。據(jù) Georgieva等［12］（2009）報道，分離自保加利亞奶酪中的8株植物乳桿菌水解乳蛋白后形成的游離氨基酸濃度為0.170～0.609 mmol／L。呂加平等［13］測得保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌水解乳蛋白后游離氨基酸質(zhì)量濃度為61.0～144.6 mg／L和2.4～14.8 mg／L。

圖2 植物乳桿菌K25在脫脂乳（10 g／d L），37℃條件下發(fā)酵過程中蛋白水解活性變化曲線Fig.2 Curves of the proteolytic activity of L.plantarum K25 in reconstituted skim milk（10 g／d L）at 37℃

2.3 植物乳桿菌K25自溶活性

乳酸菌在干酪成熟過程中，往往會發(fā)生自身溶解從而釋放出胞內(nèi)酶，對干酪成熟過程中感官質(zhì)量和質(zhì)構(gòu)特性的形成有一定影響。圖3顯示了植物乳桿菌K25的自溶活性試驗結(jié)果。隨著放置時間的延長，植物乳桿菌K25的自溶活性逐漸增強。在48 h時，其自溶活性達到最高，OD600減少量為0.707±0.034。Franciosi等［14］（2009）用相同的方法測得嗜熱鏈球菌和乳酸鏈球菌的自溶活性，在48 h后OD600減少量分別為0.142±0.030和0.178±0.019。植物乳桿菌K25的自溶活性明顯高于嗜熱鏈球菌和乳酸鏈球菌，可作為附屬菌株應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中。

圖3 植物乳桿菌K25自溶活性試驗Fig.3 Autolytic activity of L.plantarum K25

2.4 植物乳桿菌K25抑菌活性

從表2可知，植物乳桿菌K25對4株致病菌表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用，對福氏志賀氏菌的抑制作用強，對沙門氏菌的抑制作用良好，對金黃色葡萄菌和大腸桿菌的抑制作用較弱，而對兩株發(fā)酵劑菌株沒有抑制作用。

表2 植物乳桿菌K25抑菌活性試驗Tab.2 Antimicrobial activity of L.plantarum K25

抑菌活性是益生菌得一項重要特性。通過本試驗分析了植物乳桿菌K25的抑菌活性，結(jié)果表明植物乳桿菌K25在生長過程中可能會產(chǎn)生細菌素，從而來抑制致病菌。據(jù)相關(guān)文獻報道，乳酸菌能產(chǎn)生細菌素是很普遍的現(xiàn)象，這種特性有助于它們的定植以及在與其他菌株競爭時占據(jù)優(yōu)勢。乳酸菌的抑菌活性取決于很多因素，其中包括發(fā)酵乳制品p H的降低，乳酸菌產(chǎn)生的有機酸、過氧化氫以及細菌素等［15］。實際上，發(fā)酵乳制品的p H降低能抑制一些致病菌生長，這是因為未分解的乳酸能降低細胞內(nèi)部的p H，引起細胞膜電荷的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。近年來，產(chǎn)細菌素乳酸菌已被廣泛應(yīng)用于干酪發(fā)酵劑的生產(chǎn)中，以提高干酪的安全性及品質(zhì)［16］。

2.5 植物乳桿菌K25抗生素藥敏試驗

抗生素藥敏性一般分為耐藥（R）、中度敏感（MS）以及高度敏感（S）3個級別。從表3可知，植物乳桿菌K25對紅霉素高度敏感，而對頭孢噻肟和氯霉素中度敏感，對青霉素、氯霉素、赤霉素、利福平、硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素、硫酸慶大霉素以及鹽酸萬古霉素均耐藥。R?nk?等［17］（2003）發(fā)現(xiàn)短乳桿菌ATCC 8287和ATCC 14869T對萬古霉素有耐藥性。Essid等［18］（2009）采用瓊脂片擴散法對分離自腌肉中的17株植物乳桿菌進行了藥敏性分析，發(fā)現(xiàn)所有菌株均對諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、頭孢呋辛以及硫酸鏈霉素敏感，而對四環(huán)素有耐藥性，88.2%的菌株對紅霉素和利福平有耐藥性，70.5%的菌株對青霉素有耐藥性。

表3 植物乳桿菌K25抗生素藥敏試驗Tab.3 Antibiotic susceptibility of L.plantarum K25

2.6 抑菌劑對植物乳桿菌K25生長的影響

從表4可以看出，3種抑菌劑對植物乳桿菌K25的生長均有不同程度的影響。丙酸鈣對植物乳桿菌K25的生長無顯著影響。當氯化鈉質(zhì)量濃度在3 g／d L和6 g／d L，山梨酸鉀質(zhì)量濃度在0.1 g／d L和0.2 g／d L時，其對植物乳桿菌K25的生長無顯著影響，植物乳桿菌K25表現(xiàn)出很好的適應(yīng)性，相對增長率在80%～90%之間。而當氯化鈉質(zhì)量濃度在8 g／d L以上，山梨酸鉀質(zhì)量濃度在0.5 g／d L以上時，植物乳桿菌K25的生長受到抑制，相對增長率在15%～54%之間。

抑菌劑的應(yīng)用已成為影響乳酸菌生長的重要因素。抑菌劑能有效抑制食品中有害微生物的生長，同時也會影響食品中發(fā)酵菌株或其他益生菌的生長。在天然干酪中，氯化鈉的質(zhì)量濃度一般在0.7～6 g／d L之間，對不同干酪的品質(zhì)、質(zhì)地以及風味的形成有重要作用。高質(zhì)量濃度氯化鈉能影響干酪中發(fā)酵劑菌株和有害微生物的生長［19］。山梨酸鉀和丙酸鈣能有效地抑制食品中酵母菌、霉菌及細菌的生長，被廣泛應(yīng)用到干酪生產(chǎn)。通常在新鮮干酪生產(chǎn)中，山梨酸鉀的質(zhì)量濃度為0.05～0.1 g／d L。本研究中，植物乳桿菌K25只對高質(zhì)量濃度的氯化鈉和山梨酸鉀敏感，因此，通常應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中的抑菌劑濃度，不會影響植物乳桿菌K25的生長。

表4 抑菌劑對植物乳桿菌K25生長的影響試驗Tab.4 Effect of microbe inhibitory agents on growth of L.plantarum K25

2.7 植物乳桿菌K25在冷藏期間存活能力及發(fā)酵乳p H值變化

植物乳桿菌 K25初始菌數(shù)為7.58±0.11 lg cfu／m L，發(fā)酵20 h后，活菌數(shù)達到9.22±0.04 lg cfu／m L。從圖4可以看出，4℃冷藏期間，植物乳桿菌K25的活菌數(shù)隨著天數(shù)的增加而逐漸減少，在第28天時，活菌數(shù)為8.74±0.08 lg cfu／m L，與冷藏期第1天的活菌數(shù)相比差異不顯著（P＜0.05）。這表明植物乳桿菌K25在冷藏期間的存活能力較好。據(jù) Nighswonger等［20］（1996）研究發(fā)現(xiàn)，把嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌以附屬菌的形式添加到酸奶中，其在冷藏期間的活菌數(shù)發(fā)生明顯下降，在貨架期末，活菌數(shù)降至5～7 lg cfu／m L之間。Shah等［21］（1995）報道，有些益生菌發(fā)酵乳制品中的活菌數(shù)甚至降至5 lg cfu／m L以下。

隨著益生菌概念的深入推廣，針對如何提高發(fā)酵乳制品在貨架期內(nèi)益生菌的活菌數(shù)，已成為目前重要的研究課題。雖然目前對益生菌在貨架期末活菌數(shù)含量還沒有標準，但是一般認為益生菌的活菌數(shù)至少在6 lg cfu／m L以上，才能發(fā)揮其益生作用［22］。本試驗的植物乳桿菌K25符合這一要求。

發(fā)酵乳在整個冷藏期間，p H的變化不顯著（P＞0.05），表明植物乳桿菌K25對發(fā)酵乳冷藏期間的p H 值影響不大。Fran?ois等［23］（2004）研究也表明了在乳中添加植物乳桿菌不會造成酸奶的后酸化。

3 結(jié)語

圖4 植物乳桿菌K25在4℃冷藏期間存活能力及發(fā)酵乳p H值變化Fig.4 Viability of L.plantarum K25 and pH change of fermented milk during cold storage

對益生性植物乳桿菌K25技術(shù)特性的研究，結(jié)果表明該菌株凝乳活性較低，蛋白質(zhì)水解活性一般，而自溶活性較高。該菌株對致病菌有較好的抑制作用，而對發(fā)酵劑菌株無抑制作用。藥敏試驗確定了該菌株對常見抗生素的敏感性，其中對紅霉素高度敏感。將該菌株添加到發(fā)酵乳中，4℃冷藏期28 d，表現(xiàn)出了很好的存活能力，活菌數(shù)仍保持在8 lg cfu／m L以上，并能夠經(jīng)受住乳制品生產(chǎn)中常用抑菌劑的影響。此外，該菌株應(yīng)用于發(fā)酵乳中不會產(chǎn)生后酸化現(xiàn)象。本研究結(jié)果為植物乳桿菌K25應(yīng)用于功能性乳制品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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Technological Properties ofLactobacillus plantarumK25

WANG Ji1，ZHANG Xue2，LI Da2，ZHANG Zhuo－dan3，HOU Ju－min4，NIU Chun－h(huán)ua2，YANG Zhen－nai＊1，2，3，4

（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130018，China；2.Center of Agro－Food Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China；3.College of Quartermaster Technology，Jilin University，Changchun 130062，China；4.College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，China）

The aim of the present study was to evaluate the technological properties of a probiotic strainLactobacillus plantarumK25，isolated from Tibetan kefir.The results showed that the strain displayed weak milk－coagulating activity，some proteolytic activity and strong autolytic activity.The strain also showed a strong antimicrobial activity against Shigella，while no inhibition was observed towards the commercial yogurt starters.Antibiotic susceptibility test found that the strain was sensitive to erythrocin.Among all the microbe inhibitory agents in the test，only calcium propionate did not significantly affect the growth of the strain.Furthermore，the strain maintained high viability in fermented milk during storage，and it did not cause post－acidifying profile to fermented milk.

probiotic，Lactobacillus plantarum，technological properties，secondary starters

TS 252.1

A

1673－1689（2012）05－0518－07

2011－07－11

國家自然科學基金項目（31071574）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目（nycytx－0502）。

＊

楊貞耐（1965－），男，江西廣豐人，工學博士，研究員，博士研究生導師，主要從事乳品科學方面的研究。E－mail：zyang＠cjaas.com