甲基蓮心堿對(duì)耐長(zhǎng)春新堿人胃癌細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)機(jī)制的初步研究

石書(shū)紅 張 輝

多藥耐藥(MDR)是化療失敗的主要原因，尋找有效的逆轉(zhuǎn)劑一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。甲基蓮心堿(neferine,Nef)是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提出的1種雙芐基異喹啉生物堿，是1種心血管方面副作用較小的新的鈣通道阻滯劑[1]。我們已研究發(fā)現(xiàn)Nef具有增強(qiáng)化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用[2]，在體外有化療增敏作用,本身無(wú)細(xì)胞毒作用[2]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究Nef對(duì)耐長(zhǎng)春新堿人胃癌細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制，為開(kāi)發(fā)具有臨床意義的MDR逆轉(zhuǎn)劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甲基蓮心堿(neferine,Nef)由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室提供；長(zhǎng)春新堿(vincristine,VCR)為廣州明興制藥廠生產(chǎn)；維拉帕米(verapamil,VRP)為上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品；MTT(噻唑藍(lán))為Sigma公司產(chǎn)品；鼠抗人Bcl-2單抗為北京中山生物工程公司產(chǎn)品；SP免疫組化試劑盒為福州邁新生物公司產(chǎn)品；小牛血清購(gòu)自杭州四季清；RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco BRL公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC7901/VCR和SGC7901細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化病研究所惠贈(zèng)。用含10%小牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中SGC7901/VCR 細(xì)胞加0.8～1 μg/ml VCR維持耐藥，撤藥后2周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)VCR或Nef對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

參照文獻(xiàn)[2]方法，以0.5×105/ml cell接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同濃度的Nef和(或)VCR，調(diào)零組和對(duì)照組加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)平行孔。培養(yǎng)72 h后，每孔加5 mg/ml MTT 20 μl(調(diào)零組除外)，再培養(yǎng)4 h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO 100 μl/孔，待甲臢完全溶解后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)570 nm處調(diào)零后讀取吸光度值(A)。取4孔A值的均數(shù)，按以下公式計(jì)算IR,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)(IR)= (1-試驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值)×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用孫氏法求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，并按下列公式計(jì)算耐藥及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

耐藥倍數(shù)=耐藥株IC50/ 敏感株IC50

逆轉(zhuǎn)(增敏)倍數(shù)=IC50(VCR)/ IC50(VCR+Nef)

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)

將含10 μmol/L Nef的培養(yǎng)液與細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞制成1×106/ml的懸液，PBS洗2次，加入一抗(1∶100)20 μl，4℃避光反應(yīng)45 min，用含2%小牛血清的PBS洗2次后，加入FITC標(biāo)記的二抗(1∶200)20 μl，混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗3次,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度,每次測(cè)定5 000個(gè)細(xì)胞。

1.5 免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)

將Nef加入6孔培養(yǎng)板中與細(xì)胞爬片培養(yǎng)24 h后，去掉培養(yǎng)液，用95%乙醇固定30 min。按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。結(jié)果判定：細(xì)胞膜和(或)胞質(zhì)被染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Nef 的細(xì)胞毒性效應(yīng)

由表1可見(jiàn)，不同濃度的Nef(2.5～10 μmol/L )對(duì)SGC7901及SGC7901/VCR細(xì)胞無(wú)顯著毒性作用。

表1 Nef 對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(IR,%；n=3)

2.2 Nef 逆轉(zhuǎn)SGC7901和SGC7901/VCR對(duì)VCR耐藥性的作用

由表2可見(jiàn)，細(xì)胞株SGC7901/VCR對(duì)VCR的IC50為2.32 μg/ml，而對(duì)應(yīng)的敏感細(xì)胞株SGC7901對(duì)VCR的IC50為0.059 μg/ml，可見(jiàn)細(xì)胞株對(duì)VCR的耐藥倍數(shù)為39倍。不同濃度Nef均能逆轉(zhuǎn)SGC7901/VCR對(duì)VCR的耐藥性，且呈劑量依賴(lài)性；相同濃度下，Nef逆轉(zhuǎn)活性較VRP高(P<0.01)，且對(duì)敏感細(xì)胞株SGC7901有增敏作用。

表2 Nef 逆轉(zhuǎn)SGC7901及SGC7901/VCR對(duì)VCR的耐藥作用；n=3)

與對(duì)照組(單用VCR)比較，*為P<0.05,**為P<0.01；與VRP組比較，##為P<0.01

2.3 Nef對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，SGC7901/VCR與SGC7901相比波峰右移，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明SGC7901/VCR細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平增高。經(jīng)10 μmol/L Nef處理24 h后，波峰左移，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度減弱，同時(shí)對(duì)其陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SGC7901細(xì)胞中 Bcl-2蛋白表達(dá)率為2.95%，而SGC7901/VCR細(xì)胞中其表達(dá)率為31.94%，兩組比較，P<0.01；SGC7901/VCR細(xì)胞中Bcl-2呈高表達(dá)，經(jīng)10 μmol/L Nef處理24 h后，其陽(yáng)性表達(dá)率下降至3.19%，與SGC7901/VCR對(duì)照組相比較，P<0.01，有顯著性差異；結(jié)果表明Nef能下調(diào)SGC7901/VCR細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)結(jié)果

Bcl-2陽(yáng)性顆粒位于胞質(zhì)和(或)胞膜，MDR細(xì)胞SGC7901/VCR中 Bcl-2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在SGC7901細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，經(jīng)10 μmol/L Nef處理24 h后，SGC7901/VCR細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)呈陰性；表明Nef能下調(diào)SGC7901/VCR細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平。

3 討論

甲基蓮心堿是1種新的鈣通道阻滯劑，已有研究表明[1]具有與維拉帕米相似的心血管方面的作用。而維拉帕米是1種公認(rèn)的體外具有強(qiáng)逆轉(zhuǎn)MDR活性的逆轉(zhuǎn)劑[3～5]，常做為研究MDR逆轉(zhuǎn)劑的陽(yáng)性對(duì)照物。已有實(shí)驗(yàn)證明[3～5]維拉帕米必須在2 μmol/L以上，才具有逆轉(zhuǎn)MDR作用，但其在體內(nèi)血漿濃度達(dá)1～2 μmol/L時(shí)，就產(chǎn)生明顯心臟毒性：如心率減慢、低血壓、房室傳導(dǎo)阻滯、左心衰，進(jìn)而限制其在臨床應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示，2.5、5、10μmol/L Nef能使VCR對(duì)SGC7901/VCR細(xì)胞的IC50從2.32 μg/ml依次下降至0.340、0.128、0.053 μg/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為6.8、18.1、43.8。在濃度為10 μmol/L時(shí)，Nef逆轉(zhuǎn)活性較VRP為高。說(shuō)明Nef能逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR的多藥耐藥性,逆轉(zhuǎn)活性較維拉帕米強(qiáng)。另外對(duì)敏感株SGC7901細(xì)胞有化療增敏作用。

細(xì)胞凋亡是1種區(qū)別于細(xì)胞壞死的、主動(dòng)的、程序化的細(xì)胞死亡形式，細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的平衡被破壞時(shí)，腫瘤就發(fā)生，故在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位[6]。研究已表明細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)[7]。 Bcl-2 是重要的凋亡抑制基因，其過(guò)度表達(dá)可抑制多種因素如：射線、抗癌藥及去除IL-3等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性的機(jī)制之一。它與傳統(tǒng)的腫瘤耐藥機(jī)制不同，不能阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不抑制藥物引起的DNA損傷，也不改變細(xì)胞對(duì)DNA的修補(bǔ)速率和細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)，而是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑，延長(zhǎng)細(xì)胞存活期導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生。在這一延長(zhǎng)的存活期內(nèi)腫瘤細(xì)胞可發(fā)生生化或遺傳學(xué)改變，從而按經(jīng)典方式產(chǎn)生耐藥或者只受藥物損傷的腫瘤細(xì)胞存活到藥物作用消失后，自我修復(fù)，恢復(fù)功能[8～11]。研究發(fā)現(xiàn)[12，13]bcl-2能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受性，與對(duì)照組相比，bcl-2并不影響藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，但對(duì)維持細(xì)胞存活起重要作用。在化療藥物去除后，bcl-2蛋白能重新啟動(dòng)細(xì)胞增殖，使細(xì)胞獲得耐藥性。這說(shuō)明bcl-2在腫瘤MDR發(fā)生中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SGC7901/VCR細(xì)胞高表達(dá)bcl-2，而SGC7901細(xì)胞不表達(dá)Bcl-2，表明SGC7901/VCR細(xì)胞的MDR與 bcl-2過(guò)度表達(dá)有關(guān)。經(jīng)10 μmol/L Nef處理24 h后，bcl-2表達(dá)水平顯著下降，表明Nef可能通過(guò)下調(diào)bcl-2表達(dá)水平而逆轉(zhuǎn)MDR，因此，我們認(rèn)為在心血管方面副作用較小的甲基蓮心堿對(duì)于逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性具有重要意義。

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