豇豆枯萎病病原分離鑒定

吳仁鋒，楊紹麗，萬鵬，金利容

(1.武漢市農業(yè)科學技術研究院蔬菜科學研究所，湖北 武漢 430065；2.湖北省農業(yè)科學院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064)

豇豆(Vignaunguiculata(L.) Walp.)作為全球范圍內最重要的豆類作物之一，廣泛栽培于熱帶亞熱帶地區(qū)和部分溫帶地區(qū)如非洲、亞洲、南美洲、地中海盆地和美國南部.豇豆也是我國重要的常規(guī)蔬菜品種之一，常年栽培面積達67萬hm2以上.隨著豇豆產業(yè)的發(fā)展，在生產中，常因栽培管理不當或環(huán)境條件的影響，造成病害的流行，特別是土傳病害，由于重茬現(xiàn)象嚴重，有利于土傳病害病原菌的生長繁殖，發(fā)生面積大、危害嚴重，對產量和品質的影響極大.

豇豆枯萎病[1]是豇豆上發(fā)生的一種重要土傳病害，在我國許多豇豆產區(qū)普遍發(fā)生，特別是在高溫高濕條件下，產量損失可達到70%左右.目前，對該病的研究主要集中在病害發(fā)生防治、病害侵染、抗性篩選等方面[2-6]，關于該病病原菌分離鑒定的詳細報道尚少見.湖北武漢新洲雙柳作為湖北最大的豇豆生產基地，近年來，隨著種植面積的不斷擴大與栽培年限的增加，豇豆枯萎病發(fā)生危害逐年加重，嚴重限制了豇豆產業(yè)的發(fā)展，給種植戶、加工企業(yè)造成了較大的經濟損失.本研究對武漢不同豇豆種植區(qū)的枯萎病病樣采集分離，并采用致病性測定、形態(tài)學及分子生物學方法對病原菌進行鑒定，旨在弄清引起武漢地區(qū)豇豆枯萎病的病原，為豇豆無公害化防控提供技術支持.

1 材料與方法

1.1標本來源與病原菌的分離純化標樣于2008-2009年分別采自武漢市蔬菜研究所實驗基地、武漢市新洲區(qū)雙柳街汪林村、武漢市新洲區(qū)雙柳街汪鋪村.參照文獻[7]中有關病原真菌的分離方法，選取新發(fā)病的根莖作為分離材料，進行常規(guī)組織分離，經單孢純化、培養(yǎng)獲得單孢菌株，分別編號為JKW-1、JKW-2、JKW-3.

1.2致病性測定采用Kochps法將發(fā)病組織上分離到的病原菌純培養(yǎng)物(孢子)制成懸浮液(孢子濃度為105～106個·mL-1).采用自然傷根浸孢子液接種植株.取生長良好長出兩片真葉的豇豆苗，用無菌水將根莖部表面沖洗干凈，然后使根完全浸在孢子懸浮液中30 min，最后將植株定植在裝有滅菌沙土的花盆中.每個菌株接種8株苗，設置3次重復，以無菌水為對照，并置于25 ℃下光照培養(yǎng)箱中.接種后每隔1～2 d觀察癥狀.發(fā)病后，從病株再次分離病原菌，確認致病菌.

1.3病原菌形態(tài)與培養(yǎng)性狀測定將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下恒溫培養(yǎng).5 d后觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，制作玻片在光學顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特征，測量分生孢子的大小.

1.4 病菌核糖體RNA基因內轉錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列比較

1.4.1 菌絲體的培養(yǎng)與收集 將斜面保存的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上進行活化.將活化的菌株移接在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上(每皿約30 mL培養(yǎng)基)，每皿均勻接種2個菌絲塊，每菌株接2～3個平板.于25 ℃暗培養(yǎng)4～6 d后，用滅菌解剖刀刮取菌絲，置于4 ℃保存?zhèn)溆?

1.4.2 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltriethylammonium bromide，CTAB)法提取和純化[8].將300 mg菌絲體放入已滅菌的研缽中，倒入適量液氮充分研磨，將菌絲粉末裝入滅菌的1.5 mL離心管中.每一離心管中加入600 μL 2×CTAB提取緩沖液(0.7 mol/L NaCl；100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA；10 g/L PVP-360；20 g/L CTAB；0.1%β-巰基乙醇)，渦旋混勻，65 ℃水浴鍋中溫浴30 min，期間顛倒混勻3次.每管加入600 μL 氯仿/異戊醇(體積比24∶1)抽提液，充分混勻后于12 000 r/min離心15 min.吸取上清液至干凈離心管中，加等體積氯仿/異戊醇再抽提一次.將上清轉入干凈的離心管中，加2倍體積的無水乙醇沉淀20 min，16 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用70%冰乙醇沖洗2遍.將離心管置于37 ℃溫箱中干燥后用TE溶解沉淀，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4.3 ITS擴增 用真核生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增[9].其序列為，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.

1.4.4 PCR反應條件 PCR反應體系總體積為50 μL，反應液組分為：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和ITS4(25 μmol/L)各1 μL，用ddH2O使總體積達到50 μL，在PTC-100 PCR擴增儀上擴增.擴增條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.PCR產物委托南京金斯瑞生物公司進行純化和測序.

1.4.5 ITS序列分析 將測序所得的菌株的核糖體DNA-ITS序列與互聯(lián)網GenBank中核酸數據庫中的ITS區(qū)相關序列進行同源性比較 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).

2 結果與分析

2.1豇豆枯萎病菌的分離和純化從田間采集發(fā)病植株，切取病莖病健交界處的維管束組織，按常規(guī)的組織分離法進行分離.通過組織分離，獲得3個枯萎病菌菌株，即JKW-1、JKW-2、JKW-3.選取代表性的菌株進行單孢純化后，用于致病性測定.

2.2致病性測定將菌株JKW-1、JKW-2和JKW-3的分生孢子懸浮液接種自然傷根的豇豆植株，結果表明，分生孢子懸浮液接種植株基本都能發(fā)病.接種后初期病株下部葉片先變黃，逐漸向上發(fā)展，病葉葉脈變褐，近脈的葉肉組織變黃，終致葉片干枯、脫落，對照植株不發(fā)病(圖1).致病性測定發(fā)現(xiàn)：JKW-1和JKW-3易發(fā)病、致病性較JKW-2強，癥狀與田間發(fā)病相同，從病斑處再次分離得到的菌株均與原菌株相同.致病性測定證明三者均為致病病原菌.

圖1 枯萎病菌接種豇豆的致病性

2.3病原菌形態(tài)與培養(yǎng)性狀菌株JKW-1在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃上培養(yǎng)，菌落近圓形，氣生菌絲白色絮狀或粉絨狀，培養(yǎng)基表面紫紅色，背面深紫色.菌株菌絲濃密，呈同心輪紋，質地厚實，氣生菌絲茂盛.大型分生孢子較易產生，鐮刀形，頂細胞漸尖并彎曲成喙狀，基細胞足狀，多數為3隔，少數為4～7隔，大小為20.1～45.0 μm×2.5～5.1 μm；小型分生孢子為卵形或橢圓形，0～1個分隔，大小為 5.1～16.7 μm×2.0～5.1 μm；厚垣孢子較易產生，頂生或間生，多數單個，球形，細胞壁粗糙 (圖2).

圖2 枯萎菌菌株JKW-1的形態(tài)

菌株JKW-2在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃上培養(yǎng)，菌落近圓形，初期菌落為白色，中間逐漸出現(xiàn)粉紫色，背面輻射狀紫紅色，氣生菌絲少，貼著培養(yǎng)基平面生長.大型分生孢子較易產生，紡錘形至鐮刀形，頂細胞漸尖并彎曲成喙狀，基細胞足狀，多數為3隔，少數為4～7隔，大小為20.6～56.6 μm×3.1～6.4 μm；小型分生孢子為卵形或棍棒狀，0～1個分隔，大小為6.4～17.9 μm×2.5～5.1 μm；厚垣孢子較難產生，頂生或間生，多數單個，球形，細胞壁粗糙 (圖3).

圖3 枯萎菌菌株JKW-2的形態(tài)

菌株JKW-3在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)，菌落為白色無色素，絨毛狀，松軟，中心隆起，氣生菌絲多.大型分生孢子較難產生，頂細胞漸尖并彎曲成喙狀，基細胞足狀，多數為3隔，少數為4～7隔，大小為17.6～48.6 μm×2.0～4.6 μm；小型分生孢子為卵形或棍棒狀，0～1個分隔，大小為5.1～14.6 μm×2.0～5.1 μm；厚垣孢子頂生或間生，較易產生，多數單個，球形，細胞壁粗糙(圖4).

圖4 枯萎菌菌株JKW-3的形態(tài)

通過對3個菌株菌落形態(tài)、色素顏色、分生孢子梗、大小分生孢子形態(tài)，厚垣孢子形態(tài)等特征描述，參照Booth[10]檢索方法確定：3個枯萎病菌均為半知菌亞門尖孢鐮孢菌(FusariumoxysporumSchl.).

2.4rDNA-ITS序列分析在形態(tài)學鑒定的基礎上，采用分子生物學技術進行輔助鑒定，利用CTAB法提取菌株基因組DNA，以ITS1與ITS4為引物對ITS區(qū)進行擴增，通過對ITS區(qū)的雙向測序，將菌株的rDNA-ITS序列與互聯(lián)網GenBank中核酸數據庫進行同源性比較.對3個菌株的核糖體DNA-ITS序列進行分析，結果顯示：包括引物結合區(qū)，3個菌株的核糖體DNA-ITS基因序列長度均為544 bp，且3個菌株核糖體DNA-ITS序列完全一致.該序列與Genbank中的Fusariumoxysporum(GenBank登錄號為：AB470894、FJ233193、EF590328、EF495230、DQ459007、DQ452454、AY684920)的相應片段完全一致，同源性為100%.根據生物信息學同源性比對的結果，將該菌鑒定為尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，該分子鑒定的結果與形態(tài)學鑒定的結果一致.

3 結論與討論

本研究在病原菌鑒定中，主要根據病菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、色素、大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子的形態(tài)特征以及產孢表型參照Booth分類系統(tǒng)進行種級鑒定.根據孢子的形態(tài)和產孢表型將3個枯萎病的菌株鑒定為Fusariumoxysporum.并在形態(tài)學鑒定的基礎上，通過對病原菌rDNA-ITS區(qū)擴增所得序列與GenBank中的序列進行同源性比較.結果表明：3個枯萎病菌株與Fusariumoxysporum的同源性最高，為100%，進一步驗證了形態(tài)學鑒定結果.

從采集到的發(fā)病豇豆莖上都能夠分離到典型的枯萎病菌，3個不同地點的菌株，在菌落色澤、孢子大小、培養(yǎng)性狀和致病性等方面存在差異，其中JKW-1的培養(yǎng)性狀同何希樹[3]描述較一致.在產孢表型上，3個菌株都易產生小型分生孢子，JKW-2較JKW-1和JKW-3易產生大型分生孢子，而JKW-1和JKW-3較JKW-2易產生厚垣孢子.同時3個菌株致病性也存在一定差異，采自新洲區(qū)雙柳街汪鋪村的JKW-2比采自汪林村的JKW-1和蔬菜研究所JKW-3致病力要弱，表現(xiàn)在發(fā)病較遲且發(fā)病較輕，初步分析致病性強弱與菌絲生長形態(tài)有一定關系，菌株JKW-1和JKW-3菌絲濃密氣生菌絲旺盛，侵染過程中更容易在維管束產生菌絲分泌毒素或堵塞導管，導致寄主細胞死亡或植株萎蔫，而菌株JKW-2菌絲稀薄氣生菌絲不旺盛，侵染過程中不容易在維管束產生菌絲分泌毒素或堵塞導管，因此發(fā)病遲且輕.以上結果說明，不同地方的鐮刀菌由于外界環(huán)境、地理條件的差異同種的菌易發(fā)生變異.對3個枯萎病菌的ITS序列比較發(fā)現(xiàn)，菌株間序列完全一致，雖然3個枯萎病菌菌株分別采自新洲汪林村、新洲汪鋪村及武漢市蔬菜科學研究所3個地點，但是地理位置之間的差異并沒有體現(xiàn)在ITS序列差別上.

在真菌鑒定上應以形態(tài)學鑒定為基礎，分子鑒定為補充，rDNA-ITS序列分析結果可作為形態(tài)學鑒定的輔助驗證[11].對于引起重大經濟作物的真菌病害及屬內種間較相似的病原物，除采用病原菌的形態(tài)鑒定和柯赫氏法則證明外，分子生物學檢測手段可作為快速診斷病原物種類的可靠、簡便的技術.本研究采用形態(tài)學及分子生物學的方法對武漢地區(qū)豇豆枯萎病的病原進行鑒定，為后續(xù)工作提供基礎材料和條件.

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