兒童B(A)新亞型基因變異及家系分析*

任 倩，李春苗，劉興莉

山東省濟(jì)南市兒童醫(yī)院輸血科，山東濟(jì)南 250022

ABO血型系統(tǒng)是輸血醫(yī)學(xué)中最重要的血型系統(tǒng)，輸注ABO血型不相合的血液會(huì)引起急性溶血性輸血反應(yīng)、腎衰竭甚至死亡。因此，ABO血型的準(zhǔn)確鑒定在臨床輸血、器官移植等方面起著重要作用。在嬰幼兒血型鑒定過程中，由于其抗原、抗體的形成特點(diǎn)，給血型定型帶來困難，此時(shí)常規(guī)血清學(xué)方法可能無法準(zhǔn)確鑒定，需要應(yīng)用基因測(cè)序的方法來確認(rèn)。筆者對(duì)1例ABO血型定型困難的10個(gè)月嬰兒進(jìn)行了基因分型、家系及輸血策略分析，意在加強(qiáng)輸血科工作人員對(duì)嬰幼兒ABO血型正確定型的重視,。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，女，10個(gè)月23 d，因先天性室間隔缺損入院，輸血前檢查發(fā)現(xiàn)ABO血型正反定型不符且正定型A抗原反應(yīng)弱，術(shù)前無輸血史，同時(shí)采集其父母血液標(biāo)本進(jìn)行血型分析，家系成員均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清學(xué)分型 抽取先證者及家長(zhǎng)2～3 mL靜脈血，EDTA抗凝，采用經(jīng)典試管法進(jìn)行ABO血型正反定型。所用試劑主要包括單克隆抗A、抗B(長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，抗A1、抗AB、抗H(瑞士Sanquin公司)，抗D IgM(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)；反定型A1型、B型、O型紅細(xì)胞(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)。血型血清學(xué)分型方法和操作步驟參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》。

1.2.2熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法基因分型 用人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒(熒光定量PCR法)(江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司)進(jìn)行基因分型。

1.2.3全血基因組提取及擴(kuò)增 用全血DNA提取試劑盒(江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司)提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增目的基因,產(chǎn)物經(jīng)回收純化用于序列測(cè)定,用江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司測(cè)序試劑盒對(duì)ABO基因第1～5外顯子和第6、7外顯子進(jìn)行序列測(cè)定。ABO基因參考序列為ABO*A1.01.1等位基因序列(GenBank：AJ536122)。

2 結(jié) 果

2.1血清學(xué)定型結(jié)果 血型血清學(xué)結(jié)果見表1。正定型，先證者與其母親紅細(xì)胞與抗A發(fā)生弱凝集(2+)，與抗B發(fā)生強(qiáng)凝集(4+)，與抗A,B發(fā)生強(qiáng)凝集(4+)，與抗H發(fā)生強(qiáng)凝集(3+)；反定型，先證者血清不與A1細(xì)胞凝集，其母親血清與A1細(xì)胞發(fā)生弱凝集(±)；血清中無不規(guī)則抗體的存在。先證者父親為正常的B型血反應(yīng)格局。

表1 先證者及其家族成員的血清學(xué)結(jié)果

2.2血型基因分型 熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,先證者及其母親基因型為B/B，其父親基因型為B/O02。

2.3基因測(cè)序結(jié)果及變異分析 先證者及其母親基因型為B/B,測(cè)序結(jié)果顯示其堿基序列同時(shí)存在ABO*B101和ABO*B(A)新的堿基特征。根據(jù)NCBI網(wǎng)站血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(以ABO*A1.01.1為參考序列)，發(fā)現(xiàn)其B(A)序列中，第6外顯子c.297A>G突變，第7外顯子的突變有c.526C>G、c.657C>T、c.803G>C、c.930G>A。ABO*B(A)新之所以為“新”，是其序列結(jié)果與已知的7種B(A)亞型序列相比，其c.796并未出現(xiàn)C>A變異；先證者的父親基因分型為B/O02,測(cè)序結(jié)果顯示其具有ABO*B101和ABO*O02的堿基特征。

2.4家系分析 根據(jù)ABO血型基因第1～7外顯子測(cè)序結(jié)果顯示，先證者與其母親為B101/B(A)新，先證者父親為B101/O02，未采集到先證者姐姐的血樣。見圖1。

注：羅馬數(shù)字為世代順序，箭頭所指為先證者；“□”代表正常男性，“●”代表B101/B(A)新基因攜帶的女性。

2.5后續(xù)治療 從輸血的安全角度，給先證者選用了O型洗滌紅細(xì)胞和AB型血漿用于臨床手術(shù)及后期治療，先證者痊愈出院。

3 討 論

本研究中先證者為患有先天性室間隔缺損的新生兒，ABO血型正定型，A抗原 2+，B抗原 4+；反定型，血清與A1細(xì)胞、B細(xì)胞均不凝集，結(jié)果判定為正反定型不符。由于抗原、抗體生成的特點(diǎn)，在嬰幼兒血型鑒定過程中，常常出現(xiàn)ABO血型正反定型不符的情況，排除標(biāo)本及試劑質(zhì)量、技術(shù)操作等原因外，還可能受疾病或亞型的影響。有研究顯示，新生兒出生至18個(gè)月后ABO抗原才能充分發(fā)育，對(duì)于正定型抗原反應(yīng)較弱的血型，筆者建議加做抗H、抗A1、抗AB等，必要時(shí)進(jìn)行ABO血型基因鑒定[1-2]。

根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果顯示，先證者與其母親為B101/B(A)新。B(A)亞型由YAMAMOTO等[3]發(fā)現(xiàn)，目前已被報(bào)道的B(A)等位基因有7種[4]，其中B(A) 02和B(A)04是我國(guó)最常見的基因型[5-6]。經(jīng)與血型基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),在已知的7種B(A)亞型中，均存在796C>A位點(diǎn)的基因突變，但在本研究的基因序列里，未發(fā)現(xiàn)有相同突變位點(diǎn)的B(A)亞型等位基因,表明先證者及其母親均含有1條新的B(A)亞型等位基因。

B(A)亞型產(chǎn)生的分子機(jī)制可能是B等位基因在正常基因序列的基礎(chǔ)上發(fā)生了單堿基的突變，這種突變?nèi)绻l(fā)生在關(guān)鍵核苷酸位置上，能夠引起單個(gè)氨基酸的變化，改變糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特點(diǎn)和催化活性，使同一底物催化形成不同的產(chǎn)物[7]，從而使B等位基因具備編碼雙功能活性酶的能力，即B等位基因可以編碼具有B糖基轉(zhuǎn)移酶活性的B抗原，還可編碼具有A糖基轉(zhuǎn)移酶活性的A抗原。有研究證實(shí)，ABO*A101和ABO*B01兩個(gè)等位基因在編碼區(qū)僅有7個(gè)核苷酸的差異，其中c.297A>G、c.657C>T和c.930G>A位于密碼子的搖擺位置，不引起氨基酸的改變；而c.526C>G、c.703 G>A、c.796 C>A和c.803G>C核苷酸的變異，會(huì)引起176、235、266和268位點(diǎn)4個(gè)氨基酸的替換[8-9]。其中p.176Arg、p.235Gly、p.266Leu、p.268Gly 4個(gè)氨基酸決定糖基轉(zhuǎn)移酶A特異性，而p176Gly、p.235Ser、p.266Met、p.268Ala 4個(gè)氨基酸決定糖基轉(zhuǎn)移酶B特異性。研究中，先證者在c.526C>G、c.657 C>T、c.803G>C、c.930 G>A位點(diǎn)發(fā)生了核苷酸的變異，其中，c.657 C>T和c.930G>A不引起氨基酸的改變；c.526C>G和c.803G>C核苷酸的變異其編碼的氨基酸也隨之改變，進(jìn)而改變糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，使之具有編碼A、B抗原雙功能活性酶的功能?；谝陨戏肿踊A(chǔ)，B(A)亞型血清學(xué)主要特征為紅細(xì)胞表面表達(dá)正常量的B抗原和少量A抗原，同時(shí)血清可能存在與A1細(xì)胞、A2細(xì)胞均反應(yīng)的抗A抗體，因此在血型血清學(xué)鑒定時(shí)，易被判定為AB型。在血型鑒定過程中，應(yīng)注意反應(yīng)的凝集強(qiáng)度，對(duì)于凝集強(qiáng)度改變或者正反定型不一致的標(biāo)本，需結(jié)合血清學(xué)和基因測(cè)序方法進(jìn)行血型鑒定，以提高鑒定的準(zhǔn)確率。

王靜等[2]在4例ABO血型抗原弱化的患兒研究中發(fā)現(xiàn)，ABO血型基因調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子發(fā)生了變異，其中2例為先天性心臟病患兒，推測(cè)此類疾病可能會(huì)導(dǎo)致ABO血型抗原的弱表達(dá)。本研究通過家系分析發(fā)現(xiàn)，先證者B(A)亞型應(yīng)來自于其母親，與本身先天性室間隔缺損疾病可能沒有關(guān)系。

一般而言，臨床輸血依據(jù)ABO血型相容性原則進(jìn)行輸注，這一原則可以解決絕大部分輸血問題，但正確輸血的基礎(chǔ)是正確的血型鑒定。此病例中如果按常規(guī)原則，給B(A)亞型患兒輸注AB型紅細(xì)胞，會(huì)引起急性溶血反應(yīng)，甚至可能危及患兒的生命，因此準(zhǔn)確鑒定患兒的B(A)亞型，對(duì)于臨床輸血安全具有重要的意義，必須結(jié)合臨床實(shí)際，選擇適合的鑒定技術(shù)。