合歡皂甙Julibroside J8對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響研究

花 慧，馮 磊，張小平，張蓮芬，金 堅(jiān)*

1江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理研究室;2江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫214122;3無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，無(wú)錫214028

合歡皮為較常用中藥，中國(guó)藥典(一部)2000年版規(guī)定，合歡皮為合歡的干燥莖皮，具有解郁安神、活血消腫的作用、用于心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛等癥［1］。研究表明，合歡皮中化學(xué)成分較多，陳四平［2］等利用HPLC制備技術(shù)，從合歡皮乙醇提取物的正丁醇萃取部位分離得到一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的三萜苷類化合物。Julibroside J8是從合歡皮分離得到一種含九個(gè)糖三萜皂甙，鄭路［3］等人研究表明其體外具有抑BGC-823、Bel-7402、HeLa、PC-3MIE8、MDA-MB-435和HL-60細(xì)胞的活性，具有經(jīng)caspase家族及Bcl家族共同調(diào)控誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用，但它是否具有抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究旨在探討Julibroside J8對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其可能的機(jī)制。

1 材料

SV40病毒轉(zhuǎn)染的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)傳代株由法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈(zèng);SRB(Sigma公司); MCDB-131細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco BRL公司);胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺(華美生物工程公司);DAPI染液、TUNEL試劑盒(凱基生物公司);Annexin-V/PI雙標(biāo)記試劑盒(BD PharMin-gen公司)。

合歡皮購(gòu)自江蘇省無(wú)錫市山禾藥業(yè)股份有限公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為 Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹皮。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HMEC-1用含1 mmol/L谷氨酰胺、1 mg/L氫化可的松、10 μg/L EGF和150 mL/L小牛血清的MCDB-131培養(yǎng)液，于37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.2 合歡皂甙Julibroside J8的制備

將1 kg合歡皮分別用8 L、7 L 75%乙醇，100℃回流提取兩次，每次2 h，過(guò)濾，去渣。合并濾液，減壓回收乙醇，得浸膏120g，將所得浸膏經(jīng)D101型大孔樹脂吸附，再用水，30%乙醇，50%乙醇70%乙醇，90%乙醇各洗脫3個(gè)柱體積，收集各相，將70%乙醇相得浸膏，用100～200目的硅膠常壓分離，用體積比氯仿∶甲醇∶水為9∶1∶0.1～6.5∶3.5∶1梯度洗脫，等體積(300 mL)收集，將第33～44瓶合并，回收溶劑得浸膏，用反相色譜(色譜柱Sunfire C18，5 μL，100A，19×150 mmID;流動(dòng)相∶甲醇-水70∶30，流速:5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng):215 nm)中壓分離，按色譜單峰收集，回收溶劑，冷凍干燥得有效組分A1，經(jīng)HPLC分析純度為95.5%，將組分A1的UV、MS、IR、1H NMR、13C NMR圖譜的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］逐一比對(duì)。確定其為化合物合歡皂甙Julibroside J8結(jié)構(gòu)見圖1。將Julibroside J8溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基中過(guò)濾滅菌備用。

2.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(SRB法)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔7000-8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中放置于37℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，加入不同濃度的合歡皂甙Julibroside J8(0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 μg/mL)每個(gè)濃度設(shè)藥物作用時(shí)間6、12、24、48 h。且同時(shí)設(shè)相應(yīng)不加藥組為陰性對(duì)照組。在撤去藥物后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h去上清液，每孔輕輕加入100 g/L三氯醋酸100 μL固定，靜置5 min后移到4℃再放置1 h倒掉固定液，用去離子水洗5遍，空氣干燥。每孔加入4 g/L SRB 100 μL室溫放置30 min，用10 mL/L醋酸液洗5遍，加入150 μL 10 mmol/L Tris堿液(pH 10.5)溶解，用MK3型酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)A570處測(cè)定每孔A值。計(jì)算抑制率(%)同時(shí)繪制藥物濃度抑制率曲線，抑制率=［(對(duì)照組的A值–藥物組的A值)/(對(duì)照組的A值-空白組的A值)］×100%

2.4 DAPI染色觀察細(xì)胞核變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC-1細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)先放置蓋玻片)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)貼壁后，加入 Julibroside J8，使其終濃度為1.5 μg/mL，空白對(duì)照不加Julibroside J8，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心取出蓋玻片，加500 μL的DAPI染液洗一次;再滴加入500 μL的DAPI工作液，37℃染色15 min;棄去染色液，甲醇漂洗一次，滴加甘油。熒光顯微鏡以340/380 nm紫外光激發(fā)，以100×油鏡頭觀察、拍照。

2.5 TUNEL染色法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC-1細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)先放置蓋玻片)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)貼壁后，加入不同濃度的合歡皂甙Julibroside J8(0.5、1.5、2.5 μg/mL)作用時(shí)間48 h。且同時(shí)設(shè)相應(yīng)不加藥組為陰性對(duì)照組。以下操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6 采用Annexin-Ⅴ/PI雙標(biāo)記行流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC-1細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/瓶，24 h后加Julibroside J8，使其終濃度為0.5～2.5 μg/mL，同時(shí)不加Julibroside J8為空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，據(jù)Annexin-V/PI雙標(biāo)記試劑盒說(shuō)明操作。流式細(xì)胞儀分析，每樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞熒光信號(hào)，檢測(cè)結(jié)果采用Cellquest軟件分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 1310軟件進(jìn)行分析，組間比較采用方差分析。

圖1 Julibroside J8的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖和對(duì)HMEC-1細(xì)胞的作用Fig.1 Chemical structure and effect of Julibroside J8on HMEC-1 cells

3 結(jié)果

3.1 Julibroside J8對(duì)HMEC-1增殖的影響

在不同濃度Julibroside J8作用下，Julibroside J8對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HEMC-1均有不同的抑制作用。Julibroside J8呈劑量依賴性抑制HEMC-1細(xì)胞的增殖，抑制作用隨著Julibroside J8的濃度以及作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)。在作用濃度1 μg/mL，作用時(shí)間6 h時(shí)，抑制率達(dá)到35%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著(P＜0.01)。

3.2 Julibroside J8對(duì)HMEC-1細(xì)胞核形態(tài)的影響

HMEC-1細(xì)胞爬片后，經(jīng)DAPI染色后熒光顯微鏡拍照結(jié)果如圖2。HMEC-1空白對(duì)照細(xì)胞較弱的藍(lán)色熒光，核形態(tài)呈橢圓形，邊緣清晰，染色均勻，細(xì)胞經(jīng)樣品作用后，產(chǎn)生很強(qiáng)藍(lán)光染色。并且細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，細(xì)胞核染色體濃集，著色較重，并伴有細(xì)胞核固縮，核小體碎片增加這是細(xì)胞凋亡的明顯特征。

圖2 DAPI染色觀察HMEC-1細(xì)胞形態(tài)的變化Fig.2 The morphological changes of HMEC-1 cells by DAPI dying with microscopy

3.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞在凋亡過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂

HMEC-1細(xì)胞爬片后，經(jīng)TUNEL染色后光學(xué)顯微鏡拍照如圖3。由圖中可以看到，HMEC-1空白對(duì)照細(xì)胞核呈較弱的藍(lán)色，核形態(tài)呈橢圓形，邊緣清晰，染色均勻，細(xì)胞經(jīng)樣品作用后，細(xì)胞核呈深棕色。表明細(xì)胞經(jīng)藥物作用后產(chǎn)生了凋亡。且隨著劑量的增加細(xì)胞核呈深棕色的細(xì)胞比例也在增加，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

圖3 TUNEL染色觀察HMEC-1細(xì)胞核中DNA斷裂Fig.3 Effect of Julibroside J8on DNA fragmentation in HMEC-1 cells

3.4 檢測(cè)細(xì)胞壞死與凋亡:Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

HMEC-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的樣品作用24 h后，分別經(jīng)胰酶消化，收集5×105～106個(gè)細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Annexin V/PI雙染色，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果如圖4。在不同的濃度Julibroside J8作用下，隨加樣濃度的增大，處于右下象限的細(xì)胞即凋亡細(xì)胞明顯增多，當(dāng)Julibroside J8的濃度依次為 0.5、1.5、2.5 μg/mL時(shí)，凋亡率分別達(dá)到13.63% ±3.10%，19.55% ±4.69%，32.32% ± 6.19%，而正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為 8.34% ± 2.90%。二者統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著(P＜0.05)。

圖4 AnnexinⅤ/PI雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HMEC-1細(xì)胞的壞死與凋亡Fig.4 Representative flow cytometry analysis of cell necrosis and cell apoptosis induction in HMEC-1 cell incubated 24 h with Julibroside J8

4 討論

1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤生長(zhǎng)是血管生成依賴性的新觀點(diǎn)，并提出了“抗血管生成治療”的概念［5］。血管生成(angiogenesis)是指毛細(xì)血管從已存在的血管周圍生成的過(guò)程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與移行、形成新的血管和血管網(wǎng)，因此以血管內(nèi)皮細(xì)胞為藥物作用靶點(diǎn)從中草藥中尋找發(fā)現(xiàn)新的血管生成抑制劑正日益成為目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)。

根據(jù)以上理念，我們首先通過(guò)體內(nèi)，體外模型確定了中藥合歡皮的提取物的抑制血管生成的作用［6］，繼而以血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型，綜合運(yùn)用多種分離手段從合歡皮中篩選分析得到Julibroside J8。體外細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度Julibroside J8，作用6 h后生長(zhǎng)就受到抑制，表明Julibroside J8對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用不是因?yàn)楦淖兗?xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境而產(chǎn)生的，而是對(duì)細(xì)胞本身發(fā)生了作用。為了探明Julibroside J8抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的原因我們采用以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了分析研究。

DAPI染色法:DAPI(4，6-Diamidino-2-phenylindole，4，6-二氨基-2-苯基吲哚)是一種DNA特異性染料，與DNA產(chǎn)生非嵌入式結(jié)合，發(fā)出藍(lán)色熒光。該染料對(duì)細(xì)胞膜有半通透性，可透過(guò)正?；罴?xì)胞產(chǎn)生較弱的藍(lán)色熒光(細(xì)胞固定后熒光增強(qiáng))，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增加，對(duì)其攝取能力增強(qiáng)，產(chǎn)生很強(qiáng)藍(lán)光染色。并且正常細(xì)胞的核形態(tài)呈圓形，邊緣清晰，染色均勻，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，細(xì)胞核染色體濃集，著色較重，并伴有細(xì)胞核固縮，核小體碎片增加，因此從熒光強(qiáng)度及核形態(tài)均可鑒別出細(xì)胞發(fā)生凋亡的典型特征。TUNEL染色法則利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用標(biāo)記熒光素于凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’末端，從而準(zhǔn)確地反映DNA片段的生化特點(diǎn)與典型的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)行凋亡細(xì)胞的識(shí)別［7］。Annex-inV/PI雙染法應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用方法，具有量化凋亡變化的能力［8］。

通過(guò)上述3項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)Julibroside J8可以通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的途徑達(dá)到抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。這與文獻(xiàn)［3］報(bào)道的Julibroside J8可以誘導(dǎo)HeLa凋亡的報(bào)道相一致。但其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)理尚待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

1 Pharmacopoeia Committee of China(國(guó)家藥典委員會(huì))，Chinese Pharmacopoeia(中華人民共和國(guó)藥典)，Part A，Chemistry and Industry Publishing House(化學(xué)工業(yè)出版社)，Beijing，2000，p.111.

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