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    合歡皂甙Julibroside J8對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響研究

    2011-12-22 09:01:16張小平張蓮芬
    關(guān)鍵詞:蓋玻片合歡皮皂甙

    花 慧,馮 磊,張小平,張蓮芬,金 堅(jiān)*

    1江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子藥理研究室;2江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫214122;3無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校,無(wú)錫214028

    合歡皮為較常用中藥,中國(guó)藥典(一部)2000年版規(guī)定,合歡皮為合歡的干燥莖皮,具有解郁安神、活血消腫的作用、用于心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛等癥[1]。研究表明,合歡皮中化學(xué)成分較多,陳四平[2]等利用HPLC制備技術(shù),從合歡皮乙醇提取物的正丁醇萃取部位分離得到一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的三萜苷類化合物。Julibroside J8是從合歡皮分離得到一種含九個(gè)糖三萜皂甙,鄭路[3]等人研究表明其體外具有抑BGC-823、Bel-7402、HeLa、PC-3MIE8、MDA-MB-435和HL-60細(xì)胞的活性,具有經(jīng)caspase家族及Bcl家族共同調(diào)控誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用,但它是否具有抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究旨在探討Julibroside J8對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其可能的機(jī)制。

    1 材料

    SV40病毒轉(zhuǎn)染的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)傳代株由法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈(zèng);SRB(Sigma公司); MCDB-131細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco BRL公司);胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺(華美生物工程公司);DAPI染液、TUNEL試劑盒(凱基生物公司);Annexin-V/PI雙標(biāo)記試劑盒(BD PharMin-gen公司)。

    合歡皮購(gòu)自江蘇省無(wú)錫市山禾藥業(yè)股份有限公司,由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為 Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹皮。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    將HMEC-1用含1 mmol/L谷氨酰胺、1 mg/L氫化可的松、10 μg/L EGF和150 mL/L小牛血清的MCDB-131培養(yǎng)液,于37℃,50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

    2.2 合歡皂甙Julibroside J8的制備

    將1 kg合歡皮分別用8 L、7 L 75%乙醇,100℃回流提取兩次,每次2 h,過(guò)濾,去渣。合并濾液,減壓回收乙醇,得浸膏120g,將所得浸膏經(jīng)D101型大孔樹脂吸附,再用水,30%乙醇,50%乙醇70%乙醇,90%乙醇各洗脫3個(gè)柱體積,收集各相,將70%乙醇相得浸膏,用100~200目的硅膠常壓分離,用體積比氯仿∶甲醇∶水為9∶1∶0.1~6.5∶3.5∶1梯度洗脫,等體積(300 mL)收集,將第33~44瓶合并,回收溶劑得浸膏,用反相色譜(色譜柱Sunfire C18,5 μL,100A,19×150 mmID;流動(dòng)相∶甲醇-水70∶30,流速:5 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng):215 nm)中壓分離,按色譜單峰收集,回收溶劑,冷凍干燥得有效組分A1,經(jīng)HPLC分析純度為95.5%,將組分A1的UV、MS、IR、1H NMR、13C NMR圖譜的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]逐一比對(duì)。確定其為化合物合歡皂甙Julibroside J8結(jié)構(gòu)見圖1。將Julibroside J8溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基中過(guò)濾滅菌備用。

    2.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(SRB法)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,按每孔7000-8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中放置于37℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,加入不同濃度的合歡皂甙Julibroside J8(0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 μg/mL)每個(gè)濃度設(shè)藥物作用時(shí)間6、12、24、48 h。且同時(shí)設(shè)相應(yīng)不加藥組為陰性對(duì)照組。在撤去藥物后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h去上清液,每孔輕輕加入100 g/L三氯醋酸100 μL固定,靜置5 min后移到4℃再放置1 h倒掉固定液,用去離子水洗5遍,空氣干燥。每孔加入4 g/L SRB 100 μL室溫放置30 min,用10 mL/L醋酸液洗5遍,加入150 μL 10 mmol/L Tris堿液(pH 10.5)溶解,用MK3型酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)A570處測(cè)定每孔A值。計(jì)算抑制率(%)同時(shí)繪制藥物濃度抑制率曲線,抑制率=[(對(duì)照組的A值–藥物組的A值)/(對(duì)照組的A值-空白組的A值)]×100%

    2.4 DAPI染色觀察細(xì)胞核變化

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC-1細(xì)胞,接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)先放置蓋玻片)培養(yǎng)24 h,細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)貼壁后,加入 Julibroside J8,使其終濃度為1.5 μg/mL,空白對(duì)照不加Julibroside J8,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,小心取出蓋玻片,加500 μL的DAPI染液洗一次;再滴加入500 μL的DAPI工作液,37℃染色15 min;棄去染色液,甲醇漂洗一次,滴加甘油。熒光顯微鏡以340/380 nm紫外光激發(fā),以100×油鏡頭觀察、拍照。

    2.5 TUNEL染色法

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC-1細(xì)胞,接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)先放置蓋玻片)培養(yǎng)24 h,細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)貼壁后,加入不同濃度的合歡皂甙Julibroside J8(0.5、1.5、2.5 μg/mL)作用時(shí)間48 h。且同時(shí)設(shè)相應(yīng)不加藥組為陰性對(duì)照組。以下操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

    2.6 采用Annexin-Ⅴ/PI雙標(biāo)記行流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC-1細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/瓶,24 h后加Julibroside J8,使其終濃度為0.5~2.5 μg/mL,同時(shí)不加Julibroside J8為空白對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,據(jù)Annexin-V/PI雙標(biāo)記試劑盒說(shuō)明操作。流式細(xì)胞儀分析,每樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞熒光信號(hào),檢測(cè)結(jié)果采用Cellquest軟件分析。

    2.7 統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS 1310軟件進(jìn)行分析,組間比較采用方差分析。

    圖1 Julibroside J8的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖和對(duì)HMEC-1細(xì)胞的作用Fig.1 Chemical structure and effect of Julibroside J8on HMEC-1 cells

    3 結(jié)果

    3.1 Julibroside J8對(duì)HMEC-1增殖的影響

    在不同濃度Julibroside J8作用下,Julibroside J8對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞HEMC-1均有不同的抑制作用。Julibroside J8呈劑量依賴性抑制HEMC-1細(xì)胞的增殖,抑制作用隨著Julibroside J8的濃度以及作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)。在作用濃度1 μg/mL,作用時(shí)間6 h時(shí),抑制率達(dá)到35%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著(P<0.01)。

    3.2 Julibroside J8對(duì)HMEC-1細(xì)胞核形態(tài)的影響

    HMEC-1細(xì)胞爬片后,經(jīng)DAPI染色后熒光顯微鏡拍照結(jié)果如圖2。HMEC-1空白對(duì)照細(xì)胞較弱的藍(lán)色熒光,核形態(tài)呈橢圓形,邊緣清晰,染色均勻,細(xì)胞經(jīng)樣品作用后,產(chǎn)生很強(qiáng)藍(lán)光染色。并且細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣不規(guī)則,細(xì)胞核染色體濃集,著色較重,并伴有細(xì)胞核固縮,核小體碎片增加這是細(xì)胞凋亡的明顯特征。

    圖2 DAPI染色觀察HMEC-1細(xì)胞形態(tài)的變化Fig.2 The morphological changes of HMEC-1 cells by DAPI dying with microscopy

    3.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞在凋亡過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂

    HMEC-1細(xì)胞爬片后,經(jīng)TUNEL染色后光學(xué)顯微鏡拍照如圖3。由圖中可以看到,HMEC-1空白對(duì)照細(xì)胞核呈較弱的藍(lán)色,核形態(tài)呈橢圓形,邊緣清晰,染色均勻,細(xì)胞經(jīng)樣品作用后,細(xì)胞核呈深棕色。表明細(xì)胞經(jīng)藥物作用后產(chǎn)生了凋亡。且隨著劑量的增加細(xì)胞核呈深棕色的細(xì)胞比例也在增加,呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

    圖3 TUNEL染色觀察HMEC-1細(xì)胞核中DNA斷裂Fig.3 Effect of Julibroside J8on DNA fragmentation in HMEC-1 cells

    3.4 檢測(cè)細(xì)胞壞死與凋亡:Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

    HMEC-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的樣品作用24 h后,分別經(jīng)胰酶消化,收集5×105~106個(gè)細(xì)胞,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Annexin V/PI雙染色,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果如圖4。在不同的濃度Julibroside J8作用下,隨加樣濃度的增大,處于右下象限的細(xì)胞即凋亡細(xì)胞明顯增多,當(dāng)Julibroside J8的濃度依次為 0.5、1.5、2.5 μg/mL時(shí),凋亡率分別達(dá)到13.63% ±3.10%,19.55% ±4.69%,32.32% ± 6.19%,而正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為 8.34% ± 2.90%。二者統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著(P<0.05)。

    圖4 AnnexinⅤ/PI雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HMEC-1細(xì)胞的壞死與凋亡Fig.4 Representative flow cytometry analysis of cell necrosis and cell apoptosis induction in HMEC-1 cell incubated 24 h with Julibroside J8

    4 討論

    1971年,F(xiàn)olkman提出腫瘤生長(zhǎng)是血管生成依賴性的新觀點(diǎn),并提出了“抗血管生成治療”的概念[5]。血管生成(angiogenesis)是指毛細(xì)血管從已存在的血管周圍生成的過(guò)程,包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與移行、形成新的血管和血管網(wǎng),因此以血管內(nèi)皮細(xì)胞為藥物作用靶點(diǎn)從中草藥中尋找發(fā)現(xiàn)新的血管生成抑制劑正日益成為目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)。

    根據(jù)以上理念,我們首先通過(guò)體內(nèi),體外模型確定了中藥合歡皮的提取物的抑制血管生成的作用[6],繼而以血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型,綜合運(yùn)用多種分離手段從合歡皮中篩選分析得到Julibroside J8。體外細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度Julibroside J8,作用6 h后生長(zhǎng)就受到抑制,表明Julibroside J8對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用不是因?yàn)楦淖兗?xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境而產(chǎn)生的,而是對(duì)細(xì)胞本身發(fā)生了作用。為了探明Julibroside J8抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的原因我們采用以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了分析研究。

    DAPI染色法:DAPI(4,6-Diamidino-2-phenylindole,4,6-二氨基-2-苯基吲哚)是一種DNA特異性染料,與DNA產(chǎn)生非嵌入式結(jié)合,發(fā)出藍(lán)色熒光。該染料對(duì)細(xì)胞膜有半通透性,可透過(guò)正?;罴?xì)胞產(chǎn)生較弱的藍(lán)色熒光(細(xì)胞固定后熒光增強(qiáng)),而凋亡細(xì)胞的膜通透性增加,對(duì)其攝取能力增強(qiáng),產(chǎn)生很強(qiáng)藍(lán)光染色。并且正常細(xì)胞的核形態(tài)呈圓形,邊緣清晰,染色均勻,而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣不規(guī)則,細(xì)胞核染色體濃集,著色較重,并伴有細(xì)胞核固縮,核小體碎片增加,因此從熒光強(qiáng)度及核形態(tài)均可鑒別出細(xì)胞發(fā)生凋亡的典型特征。TUNEL染色法則利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用標(biāo)記熒光素于凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’末端,從而準(zhǔn)確地反映DNA片段的生化特點(diǎn)與典型的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),進(jìn)行凋亡細(xì)胞的識(shí)別[7]。Annex-inV/PI雙染法應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用方法,具有量化凋亡變化的能力[8]。

    通過(guò)上述3項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè),結(jié)果證實(shí)Julibroside J8可以通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的途徑達(dá)到抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。這與文獻(xiàn)[3]報(bào)道的Julibroside J8可以誘導(dǎo)HeLa凋亡的報(bào)道相一致。但其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)理尚待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

    1 Pharmacopoeia Committee of China(國(guó)家藥典委員會(huì)),Chinese Pharmacopoeia(中華人民共和國(guó)藥典),Part A,Chemistry and Industry Publishing House(化學(xué)工業(yè)出版社),Beijing,2000,p.111.

    2 Chen SP,Zhang RY,Ma LB,et al.Structure determination of three saponons from the stem bark of Albizzia julibrissin Durazz.Acta Pharm Sin,1997,32:110-115.

    3 Zheng L,Zheng J,Wu LJ,et al.Julibroside J8-induced HeLa cell apoptosis through caspase pathway.J Asian Nat Prod Res,2006,8:457-465.

    4 Zou K,Tong WY,Liang H,et al.Diastereoisomeric saponins from Albizia julibrissin.Carbohydr Res,2005,340:1329-34.

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    7 Otsuki Y,Li Z,Shibata MA.Apoptotic detection methods from morphology to gene.Prog Histochem Cytochem,2003,38:275-339.

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