非典型瘋牛病研究進(jìn)展

劉雨田，孫成友，遲田英，肖衛(wèi)華，王志亮＊

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.江西省遂川縣畜牧獸醫(yī)局，江西遂川 343906）

牛海綿狀腦?。˙ovine spongiform encephalopathy，BSE）又稱(chēng)瘋牛病，是由朊病毒引起的牛的漸進(jìn)性致死性傳染病，與羊癢病、鹿慢性消耗性疾病以及人克－雅氏癥等統(tǒng)稱(chēng)為傳染性海綿狀腦?。═ransmissible spongiform encephalopathy，TSE）［1］。瘋牛病為人畜共患病，病原主要通過(guò)消化道途徑感染人。1986年，英國(guó)報(bào)道了全球第1例BSE，2年后英國(guó)查明BSE是由于牛飼用了污染癢病因子（即羊源性朊病毒）的肉骨粉而引起［2］。依據(jù)這個(gè)調(diào)查結(jié)果，各BSE發(fā)生國(guó)陸續(xù)實(shí)施反芻動(dòng)物源性肉骨粉不得飼喂反芻動(dòng)物以及剔除特定風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)等綜合防控措施，隨后全球BSE病例數(shù)急劇下降，疫情得到很好控制，防控措施取得巨大成功。學(xué)術(shù)界在2003年以前普遍認(rèn)為全球的BSE是由癢病因子（羊源性朊病毒）引起，因此樂(lè)觀估計(jì)只要牛不飼喂動(dòng)物源性飼料，全球消滅BSE指日可待。然而，在2003年，日本和意大利首次分別報(bào)道了1例和2例與典型BSE（C型BSE）不同但又類(lèi)似的病例，稱(chēng)之為非典型BSE［3］。初步研究發(fā)現(xiàn)非典型BSE的致病因子雖然也是朊病毒，但與C型BSE的病原存在分子質(zhì)量、糖基化、腦部分布等方面的差異［4－5］。此后，又有多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道類(lèi)似病例，并且有國(guó)家通過(guò)追溯查到早在2001年就已出現(xiàn)非典型BSE［6］。截止2013年底，全球的非典型BSE數(shù)量已超過(guò)60例，遍布十幾個(gè)國(guó)家，但主要還是分布于本土BSE發(fā)生國(guó)。非典型BSE病例的不斷發(fā)現(xiàn)引起世界各國(guó)和相關(guān)國(guó)際組織的高度關(guān)注，給全球BSE的防控又提出了新的挑戰(zhàn)。本文對(duì)非典型BSE的特征和特點(diǎn)進(jìn)行了概述，旨在提高人們對(duì)非典型BSE的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為完善我國(guó)BSE的防控工作提供理論支持。

1 基本特點(diǎn)

根據(jù)朊病毒的蛋白酶K抗性部分分子質(zhì)量大小，非典型BSE可以分為H型BSE（朊病毒分子質(zhì)量比C型BSE的較重）和L型BSE（朊病毒分子質(zhì)量比C型BSE的較輕）。不管是黃牛品種，還是瘤牛品種，均發(fā)現(xiàn)了非典型BSE病例［7］。據(jù)目前有限的非典型BSE病例分析，發(fā)病牛平均年齡約為11歲，是C型BSE平均年齡的2倍［8］。H型和L型BSE的病例數(shù)比例大約呈1∶1的關(guān)系［4］。至于非典型BSE的基因突變問(wèn)題，僅見(jiàn)報(bào)道美國(guó)H型BSE病例存在病毒第211號(hào)密碼子的E／K突變性［9］，然而在其他H型BSE病例中未發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)的突變性［10］。針對(duì)非典型BSE，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織專(zhuān)門(mén)召集相關(guān)專(zhuān)家進(jìn)行過(guò)兩次討論，認(rèn)為非典型BSE是一個(gè)變種，具有自發(fā)性散發(fā)性特點(diǎn)，發(fā)病率低，約為1／1 000 000～3／1 000 000，并且當(dāng)前的BSE防控措施仍然有效，無(wú)需改變?；谝陨嫌^點(diǎn)，每個(gè)養(yǎng)牛國(guó)家均有可能會(huì)出現(xiàn)非典型BSE病例，只是能不能發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題。

2 臨床癥狀與病理變化

非典型BSE沒(méi)有特征性的臨床癥狀。2007年，法國(guó)研究人員對(duì)35例非典型BSE的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，18例為臨床健康牛，其余17例為死牛或有病而急宰的牛，其中4頭死牛在死亡前表現(xiàn)為倒地不起，3頭急宰牛臨床表現(xiàn)為C型BSE的神經(jīng)性癥狀［8］。腦部接種H型BSE腦勻漿液的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種牛9個(gè)月后表現(xiàn)出精神萎靡，異常低頭，耳朵下垂，食欲下降，體況變差。隨著病程發(fā)展，病牛離群，頭抵住墻或門(mén)，連短暫的抬頭也不情愿。病牛開(kāi)始舔唇部，異常咀嚼（與進(jìn)食無(wú)關(guān)），后期它們的頻率和嚴(yán)重程度進(jìn)一步加重，同時(shí)可見(jiàn)過(guò)度流涎［9］。在另一組腦內(nèi)接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H型和L型BSE發(fā)病牛的臨床癥狀沒(méi)有差別，均表現(xiàn)出與C型BSE相似的神經(jīng)癥狀，如消沉、焦躁不安、驚恐、感覺(jué)過(guò)敏。此外，發(fā)病牛站立困難，步態(tài)異常，后肢過(guò)度伸展［11］。與C型BSE相似，非典型BSE也沒(méi)有解剖病變。通過(guò)蘇木精伊紅染色，H型和L型BSE均可見(jiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)空泡變性。在腦閂部，C型BSE的空泡化明顯比非典型BSE的嚴(yán)重。然而，在大腦部，非典型BSE（包括H型和L型）的空泡化比C型BSE的嚴(yán)重，尤其在額葉皮質(zhì)［11］。也有接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H型BSE在丘腦部核群和中腦部的空泡化最為嚴(yán)重，而在大腦皮層、小腦、基底核則呈中等程度的空泡化［10］。

3 病原在機(jī)體中的分布

腦內(nèi)接種試驗(yàn)表明，非典型BSE的病原在腦部分布明顯比C型BSE的要均勻，而且總體上L型BSE的腦部病原密度比H型BSE的要濃些［5］。H型BSE的病原廣泛分布于腦部、脊髓和視網(wǎng)膜，少量分布于腦垂體神經(jīng)部和三叉神經(jīng)節(jié)，其中病原含量最多的部分是在腦干和丘腦，而小腦、嗅球、大腦皮層僅見(jiàn)少許病原［5，9］。H型BSE在下神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、星狀神經(jīng)節(jié)、交感神經(jīng)干、面神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、視神經(jīng)、副神經(jīng)、臂神經(jīng)叢、迷走神經(jīng)、脊神經(jīng)、馬尾和腎上腺等神經(jīng)組織也能檢測(cè)到病原［10］。L型BSE的病原在腦干、基底核、嗅腦和丘腦含量最高，在大腦皮層和小腦部的含量次高，僅比腦干部（包括腦閂）的含量略低點(diǎn)［5，12］。研究還發(fā)現(xiàn)［13］，在臨床前期，L型BSE感染牛的幾個(gè)主要神經(jīng)節(jié)（包括三叉神經(jīng)節(jié)、頸部神經(jīng)節(jié)、腸系膜神經(jīng)節(jié)、星狀神經(jīng)節(jié)）、腦垂體、馬尾（脊髓末端）、迷走神經(jīng)和迷走交感干均可以檢測(cè)到病原。在臨床后期，腎上腺、前肢神經(jīng)（包括肩胛上神經(jīng)、臂神經(jīng)叢、正中神經(jīng)、橈神經(jīng)）、坐骨神經(jīng)、脛神經(jīng)、膈神經(jīng)和副神經(jīng)也能檢測(cè)到病原。然而，兩種非典型BSE的淋巴組織均未發(fā)現(xiàn)病原［10］。

4 病原分子和生化特征

在溫和工作濃度（50μL／mL）的蛋白酶K（proteinase K，PK）處理60min（37℃）后，用抗朊病毒核心片段單克隆抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)L型BSE病原的雙糖基化、單糖基化和無(wú)糖基化3條蛋白帶的組成比例分別為39.3%±0.6%、35.0%±1.0%和26.3%±1.2%，分子質(zhì)量大小分別為26.3ku±0.6ku、20.7ku±0.6ku和17.3ku±0.6ku，3條蛋白帶的分子質(zhì)量均比C型BSE病原的對(duì)應(yīng)條帶小1個(gè)ku左右。而H型BSE病原的雙糖基化、單糖基化和無(wú)糖基化蛋白帶的組成比例與C型BSE的類(lèi)似，分別為58.3%±2.5%、29.3% ±0.6%和12.7% ±3.5%，分子質(zhì)量大小分別為28.7ku±1.5ku、23.3ku±1.2ku和19.3ku±1.2ku，3條蛋白帶的分子質(zhì)量比C型BSE的對(duì)應(yīng)條帶均大1.5個(gè)ku左右［4］。因牛的個(gè)體差異、單抗的不同或PK酶處理的差異，其他研究結(jié)果與上述數(shù)據(jù)相比略有不同，但總體上一致［5，10］。將 PK 酶作用時(shí)間延長(zhǎng)（工作濃度為50μL／mL）或?qū)⑵涔ぷ鳚舛忍岣叩?50μL／mL及以上進(jìn)行處理，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C型BSE病原對(duì)PK酶的抵抗性最強(qiáng)，L型BSE的次之，H型BSE的最弱［4－5］。用 N－糖酰胺酶F（一種去糖基化酶）處理后，發(fā)現(xiàn)L型BSE的病原對(duì)該酶最敏感，糖基化的去除也最為完全，而H型BSE的次之，C型BSE的最不敏感。應(yīng)用抗朊病毒C端抗體檢測(cè)，還發(fā)現(xiàn)H型BSE多了一條10ku大小的條帶，而L型和C型BSE的則沒(méi)有［4，10］。試驗(yàn)表明，抗朊病毒N端抗體僅能檢測(cè)到H型BSE的3條蛋白帶，而對(duì)于C型和L型BSE，要么信號(hào)很弱，要么檢測(cè)不到。用抗朊病毒核心片段或C端抗體則可以檢測(cè)到所有類(lèi)型BSE的3條蛋白帶［4］。另外，H型和L型BSE的病原均能在腦部如大腦白質(zhì)、基底核和丘腦等處形成淀粉樣斑塊［10］，而 C型 BSE沒(méi)有這種特征［3］。

5 傳染性

目前證實(shí)，人工條件下L型BSE病原可以感染家牛［14］、綿羊［15］、倉(cāng)鼠［16］、獼猴［17］、狐猴［18］、野生型小鼠（第一代接種不發(fā)病，呈亞臨床感染狀態(tài)，第2代接種才感染發(fā)?。?9］、表達(dá)人朊蛋白［20］和牛朊蛋白［21］的轉(zhuǎn)基因小鼠。而關(guān)于H型BSE的感染性試驗(yàn)報(bào)道較少，就現(xiàn)有資料表明，H型BSE病原可以感染家牛［14］、表達(dá)牛朊蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠［21］、野生型小鼠（第一代接種就感染發(fā)?。?2］。在感染表達(dá)人朊蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L型BSE的感染率比C型BSE的明顯高，達(dá)到100%，而H型BSE不能使小鼠發(fā)病，感染率為0［20］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與C型BSE（平均潛伏期為230d）比較，L型BSE感染表達(dá)牛朊蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的潛伏期明顯縮短（平均潛伏期為185d），而H型BSE的潛伏期明顯延長(zhǎng)（平均潛伏期為330d）［21］。目前數(shù)據(jù)提示L型BSE比C型BSE具有更強(qiáng)的傳染性。

6 診斷方法

不管是L型還是H型BSE，其病原在腦閂部的含量均較高，因此C型BSE的檢測(cè)手段（采集腦閂部組織進(jìn)行檢測(cè)）也適合于非典型BSE。應(yīng)用各種類(lèi)型BSE的病料進(jìn)行試驗(yàn)，比較目前常用的BSE快速篩檢方法敏感性，發(fā)現(xiàn)Idexx HerdChek BSEScrapie短型方法具有最高的敏感性，其次是AJ Roboscreen BetaPrion方法、PrionScreen Check Western方法和Idexx HerdChek BSE－Scrapie超短型方法［23］。它們的敏感性均達(dá)到歐盟的相關(guān)要求。在非典型BSE確診方面，一般應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫印跡方法，因此只要選用公認(rèn)的針對(duì)朊病毒核心片段的單抗如6H4、P4、L42、F99等，就可以對(duì)非典型BSE做出確診。

7 小結(jié)

幾年來(lái)，在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）報(bào)告的BSE病例中，非典型BSE越來(lái)越多，C型BSE越來(lái)越少。這一現(xiàn)象說(shuō)明，全球BSE疫情發(fā)生了質(zhì)的變化，由過(guò)去的肉骨粉引起B(yǎng)SE疫情轉(zhuǎn)變成自發(fā)性BSE病例。然而，非典型BSE與C型BSE一樣具有較強(qiáng)的感染性，尤其是L型BSE，對(duì)多種動(dòng)物均有較強(qiáng)致病性。因此，國(guó)際上對(duì)非典型BSE不敢一絲怠慢，仍然堅(jiān)持嚴(yán)格的飼料禁令，美國(guó)更是在2009年加強(qiáng)了動(dòng)物飼料禁令。另外，歐盟、北美等發(fā)生瘋牛病的地區(qū)仍然嚴(yán)格執(zhí)行以風(fēng)險(xiǎn)為基礎(chǔ)的監(jiān)測(cè)，強(qiáng)調(diào)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)臨床疑似、死亡和緊急屠宰的牛，歐盟還對(duì)年齡大于72月齡的健康牛也進(jìn)行監(jiān)測(cè)。相信這些措施的繼續(xù)實(shí)施，今后會(huì)有更多的非典型BSE病例出現(xiàn)，同時(shí)也將非典型BSE帶來(lái)的新挑戰(zhàn)化成不可怕的普通動(dòng)物疫病事件。既然非典型BSE是一種老年牛的自發(fā)性疫病，那么不管哪個(gè)國(guó)家都應(yīng)加強(qiáng)防范，努力防止人畜感染。目前，人們對(duì)非典型BSE的認(rèn)識(shí)還非常有限，還不清楚它到底怎么來(lái)的、與什么因素相關(guān)、病原間的關(guān)系、病原在牛體內(nèi)何時(shí)才出現(xiàn)等問(wèn)題還需要解答。

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