犬細小病毒JL-M13株的分離鑒定及全基因組序列分析

仝明薇，易 立，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112）

犬細小病毒病是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染幼犬引起的一種急性傳染病，發(fā)病率高，傳染性強，病程短，病死率高［1-4］，是危害我國犬養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的傳染病之一，可造成相當大的經(jīng)濟損失。犬細小病毒于1978年由美國學(xué)者從犬糞便樣品中首次分離獲得［5］。1982年梁士哲和徐漢坤相繼報道了國內(nèi)的犬細小病毒流行情況。細小病毒屬于細小病毒科（Parvoviridae）細小病毒屬（Parvovirus）［6］，病毒粒子在電鏡下呈圓形或六邊形，無囊膜，核衣殼為軸對稱的20面體。細小病毒為線狀單股負鏈的DNA病毒，基因組含有5 323個核苷酸［7］。在抗原性上與非致病性微小病毒（Minute virus of canine，MVC）有顯著差異，而被命名為 CPV-2［8］。CPV 只有一個抗原型，即 CPV-2，在其出現(xiàn)后不斷發(fā)生抗原漂移，目前已有多個亞型，分別為 CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）及 CPV-2c（b）［9-11］。

由于CPV具有很快的變異速度，現(xiàn)在臨床使用的滅活疫苗與弱毒疫苗的免疫效果都有不同程度下降。因此，針對當前流行的CPV毒株進行研究分析，為制備更有效的疫苗奠定一定的理論基礎(chǔ)，對防控犬細小病毒病，促進犬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。本研究根據(jù)GenBank中已登錄的CPV序列，利用重疊PCR技術(shù)從CPV分離株中提取的DNA，并進行了生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 試驗用病料為吉林省長春市某犬養(yǎng)殖場疑似細小病毒癥狀犬的糞便，收集病料共16份，置-80℃保存?zhèn)溆??！?/p>

1.1.2 主要試劑 StoolGen DNA Kit、Universal DNA Purification Kit為康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；EsTaqDNA polymerase為 TaKaRa公司產(chǎn)品；F81細胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 犬細小病毒分離 取病料（0.2g），用 EMEM細胞營養(yǎng)液10倍稀釋，上下顛倒充分混勻，5 000r／min離心20min，取上清，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾后，置-20℃凍存?zhèn)溆谩⑻幚砗玫臉悠钒磁囵B(yǎng)液體積的1／10接種于F81細胞系（由本實驗室保存），同時設(shè)正常細胞對照，37℃吸附30min，加生長液繼續(xù)于37℃、體積分數(shù)為5%CO2條件下靜置培養(yǎng)4d～5d，每天觀察細胞貼壁生長情況及有無細胞病變。如無病變則于培養(yǎng)的第4d～5d收取上清，細胞繼續(xù)按常規(guī)傳代培養(yǎng)，至第5代仍無病變視為分離陰性；出現(xiàn)細胞病變的經(jīng)-20℃／37℃反復(fù)凍融3次收毒，置-20℃保存。

1.2.2 病毒基因組DNA的提取 病料DNA提取參考Stool Gen DNA Kit，提取的 DNA 用無核酸酶的水溶解，置-20℃保存。

1.2.3 犬細小病毒部分基因片段的PCR擴增 參照GenBank上已登錄的犬細小病毒（登錄號為：EU310373）基因組保守區(qū)應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計一對引物：上游引物：5′-ATCTGAGACATTGGGTTT-3′，下游引物：5′-TTTCTAGGTGCTAGTTGA-3′。兩個引物間理論的PCR產(chǎn)物為1 105bp，由Invitrogen（上海）公司合成。PCR采用25μL反應(yīng)體系：10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL、上、下游引物各1μL，EsTaq酶0.5μL，模板2μL，ddH2O 16μL，95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min 15s，30個循環(huán)；最后72℃8min。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.4 克隆片段的序列測定 將PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司（上海）進行測序分析。隨后利用Gen-Bank中的Blast分析軟件包對測序結(jié)果進行序列分析，以確定所擴增序列為犬細小病毒基因組序列。

1.2.5 犬細小病毒全基因組序列重疊PCR擴增根據(jù)克隆片段的測序結(jié)果，設(shè)計了5對引物（圖1）用于克隆病毒基因組的全基因序列。引物序列分別如下：P1：5′-GTGGCGGGCTAATTGTGG-3′；P2：5′-TGTTTGCTTATGTCTGTATGTT-3′； P3： 5′-GGTGACTCTTTGTTCGGTAA-3′；P4：5′-GCTTGTGCTATGGCTTGA-3′；P5：5′-ACGGATGGAATTGGATTA-3′；P6：5′-ACCAGAGCGAAGATAAGC-3′；P7：5′-CGCTGCTTATCTTCGCTCTG-3′；P8：5′-TTCATCTGTTTGCGCTCCC-3′；P9：5′-CTCAAATGGGAAATACAAAC-3′； P10： 5′-ATTCTAAGGGCAAACCAA-3′

圖1 病毒基因組全序列重疊PCR引物簡圖Fig.1 The map of overlapping PCR primers of virus genome

5對引物間理論的PCR產(chǎn)物分別為696、771、1 133、1 396、1 045bp。PCR采用50μL反應(yīng)體系：10×buffer 5μL，dNTPs 5μL，上、下游引物各2μL，EsTaq酶 0.5 μL，模 板 4 μL，ddH2O 31.5μL，95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min 30s，35個循環(huán)；最后72℃8min。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并在紫外燈下切割目的片段，然后用Universal DNA Purification Kit回收試劑盒進行回收和純化，并送Invitrogen公司（上海）進行測序分析。

1.2.6 病毒基因組測序結(jié)果的整理與分析 將所獲得的5次測序結(jié)果用DNA Star軟件包中的Editseq、Seqman等程序進行整理、校對，并拼接成線性全基因組序列，最后運用分子生物學(xué)軟件分析該病毒基因組與細小病毒科其他病毒的基因組遺傳變異情況等。

2 結(jié)果

2.1 犬細小病毒分離

將采集的病料接種于F81細胞，應(yīng)用同步接毒和帶毒傳代的方法分離獲得了1株犬細小病毒，命名為JL-M13。與正常細胞（圖2A）相比，JL-M13在F81細胞連續(xù)傳代3次即出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細胞腫脹變大，細胞融合成圓形或橢圓形大融合細胞，細胞間隙變大并成“拉網(wǎng)狀”（圖2B）。

圖2 細胞觀察結(jié)果Fig.2 The results of cell observation

2.2 病毒基因組部分片段的PCR擴增

病毒基因組部分片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察到一條大小約1 105bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。測序后經(jīng)Blast分析，發(fā)現(xiàn)與GenBank中犬細小病毒CPV-2毒株（EF011664.1）的同源性高達99.6%，利用測序結(jié)果設(shè)計5對引物，擴增病毒基因組全基因序列，經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳后得到大小分別約為696、771、1 133、1 396、1 045bp 的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3），PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后直接進行測序。

2.3 病毒基因組的測序結(jié)果及分析

將5次測序結(jié)果運用分子生物學(xué)軟件拼接后表明，該病毒基因組全長4 621bp，分析表明，JL-M13為Type-2型細小病毒?；蚪M包含2個ORF。ORF1編碼2種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2），ORF2編碼2種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1和VP2）。

2.4 病毒基因組的遺傳變異分析

圖3 JL-M13病毒基因組部分片段的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products of viral genome of JL-M13strain

利用生物學(xué)軟件，對所獲得細小病毒JL-M13毒株與GenBank數(shù)據(jù)庫中細小病毒參考毒株的基因組構(gòu)建進化樹表明（圖4），本研究中所獲的JL-M13毒株與CPV-2-SC02／2011毒株和CPV-s5毒株同屬于CPV-2型，并在拓撲結(jié)構(gòu)上與四川株SC02／2011非常接近，這暗示本次獲得的犬細小病毒毒株與四川流行株SC02／2011有著極其緊密地關(guān)系。

將該病毒基因組與細小病毒科中其他細小病毒基因組進行比對發(fā)現(xiàn)，從不同動物中分離得到的細小病毒，其同源性差異較大。所獲的JL-M13毒株與番鴨細小病毒（MPV）同源性最低，為30.8%；與豬細小病毒（PPV）和牛細小病毒（BPV）的同源性也較低，為33.8%～41.3%；與鼠細小病毒（MMV）同源性為66.2%；與貓泛白細胞減少癥病毒（FPV）、貂腸炎病毒（MEV）、犬細小病毒（CPV）的同源性均在98.0%以上，其中與病毒株CPV-2同源性高達99.6%（圖5）。

圖4 JL-M13病毒基因組遺傳進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of JL-M13virus genome

圖5 JL-M13病毒基因組同源性分析Fig.5 Homological analysis of JL-M13genome

3 討論

細小病毒由于自身所帶基因限制，其復(fù)制增值病毒前期所需的酶均要宿主細胞的幫助，這就要求宿主細胞必須處于對數(shù)生長期，故細小病毒培養(yǎng)多采用同步接毒的方法。本研究所獲的細小病毒毒株（JL-M13），全長4 621bp，包括2個 ORF，ORF1編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2），ORF2編碼兩種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1和VP2），這與其他細小病毒類似。將JL-M13毒株與GenBank數(shù)據(jù)庫中細小病毒參考毒株的基因組構(gòu)建進化樹表明，該毒株屬于CPV-2型，并與2011年分離的四川株SC02／2011有較密切的關(guān)系，這是否暗示著近年來犬細小病毒由南至北的流行還有待進一步研究。

病毒基因組同源性分析表明，從不同動物中分離得到的細小病毒，其核苷酸同源性差異很大。JLM13，與番鴨細小病毒同源性最低，為30.8%；與豬細小病毒、牛細小病毒和鼠細小病毒的同源性也較低，為33.8%～66.2%；與貓泛白細胞減少癥病毒、貂腸炎病毒、犬細小病毒的同源性均在98.0%以上，其中與病毒株CPV-2同源性高達99.6%。由此可見細小病毒在不同動物間有較為嚴格的種屬特性。

細小病毒自1978年由美國學(xué)者首次分離報道后，已不斷在抗原性、宿主范圍和血凝性等方面發(fā)生變異，并已出現(xiàn)多個亞型。其感染宿主也由主要感染犬科動物到已證實的CPV-2a、CPV-2b在自然條件下也能感染貓科、鼬科等多種肉食獸［12］。CPV-2a、CPV-2b被發(fā)現(xiàn)后很快取代了最初的CPV-2，二者一般呈混合感染，而應(yīng)用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的CPV-2c［13］與 CPV-2a、CPV-2b一樣，也在世界范圍廣泛分布，并有逐漸取代其他型的趨勢。我國的CPV分離株沒有形成明顯的中國CPV分支，在中國臺灣，先前的報道CPV-2a占優(yōu)勢地位，WANG H G等［1］研究發(fā)現(xiàn)在臺灣中部卻以CPV-2b為主。易立等2009年研究報道，武漢、南京和北京等城市寵物犬中流行的犬細小病毒CPV-2a亞型毒株單獨構(gòu)成一簇，并且與2008年的韓國分離株K001關(guān)系緊密，而與早期其他地區(qū)的犬細小病毒CPV-2a亞型流行株距離較遠，預(yù)示著犬細小病毒流行株的變異具有某種時間和空間相關(guān)性。本研究對犬細小病毒流行毒株的基因組序列及其變異規(guī)律，同源性等進行分析，為生產(chǎn)實踐中免疫失敗尋找原因提供基礎(chǔ)，為有針對性地采取有效的防控措施，積極防控該病提供重要參考。

［1］關(guān)瑋琨，何麗麗，馮瑜菲，等.犬細小病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（4）：407-411.

［2］Sutton D，Vinberg C，Gustafsson A，et al.Canine parvovirus type 2cidentified from an outbreak of severe gastroenteritis in a litter in Sweden［J］.Acta Vet Scand，2013，10：55-64.

［3］劉 靜，趙學(xué)剛，陸 江，等.犬細小病毒病流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（3）：199-201.

［4］Wen J X，Pan S M，Liang S.Soluble form of canine transferrin receptor inhibits canine parvovirus infectioninvitroandinvivo［J］.Biomed Res Int，2013，172479.doi：10.1155／2013／172479.

［5］姜燕霞，張淑玲，王金良，等.犬細小病毒JN株的分離鑒定及VP2基因序列分析［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34（5）：83-86.

［6］Soma T，Taharaguchi S，Ohinata T，et al.Analysis of the VP2 protein gene of canine parvovirus strains from affected dogs in Japan［J］.Res Vet Sci，2013，94（2）：368-371.

［7］易 立，程世鵬.犬細小病毒分子生物學(xué)研究進展［J］.特產(chǎn)研究，2008（1）：71-73.

［8］Lin C N，Chine C H，Chiou M T，et al.Genetic characterization of type 2acanine parvoviruses from Taiwan reveals the emergence of an Ile324mutation in VP2［J］.Virol J，2014，11：1-7.

［9］李月華，王永山，畢振威，等.犬細小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大腸桿菌中的表達［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（10）：991-998.

［10］梁 秀，胡挺松，鄭 穎，等.犬細小病毒病原分離及分型研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（5）：79-82.

［11］祝文琪，徐衛(wèi)康，陸 彥，等.犬細小病毒熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2012，34（5）：17-20.

［12］戈 銳，彭廣能，夏咸柱，等.犬細小病毒四川株的分離與鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007，29（11）：836-839.