新疆不同動(dòng)物源大腸埃希菌耐藥性比較

底麗娜，趙紅瓊，夏利寧，南海辰

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

新疆是我國牛羊重要養(yǎng)殖地區(qū)，受宗教信仰和消費(fèi)習(xí)俗的影響，牛羊肉的消費(fèi)具有一定的剛性需求和不可替代性，養(yǎng)豬業(yè)也占著重要的比重。然而，面臨養(yǎng)殖集約化程度低，官方獸醫(yī)制度不完善，治療用藥混亂，隨之而來的臨床耐藥性問題也日趨嚴(yán)重，已成為制約畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。喹諾酮類、β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類及酰胺醇類藥物具有殺菌譜廣、快速殺菌等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于臨床，為動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療做出貢獻(xiàn)。隨著臨床對上述藥物的廣泛應(yīng)用，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對這幾類藥物的耐藥性呈逐年升高的趨勢［1］。動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的迅速出現(xiàn)，不僅使得原有的抗菌藥物失去作用，導(dǎo)致動(dòng)物疾病難以控制，而且這些耐藥菌極有可能通過污染食品和環(huán)境或動(dòng)物與人的接觸過程中傳遞給人，對人類的健康構(gòu)成威脅［2］。本研究以新疆豬場、羊場和牛場代表不同來源的豬、羊、牛的糞樣中分離的大腸埃希菌作為研究對象。用微量肉湯法對上述菌進(jìn)行臨床常用抗菌藥物的最小抑菌濃度測定；分析比較不同動(dòng)物源大腸埃希菌耐藥和多藥耐藥情況，闡明大腸埃希菌耐藥性與臨床用抗菌藥物的相關(guān)性，對指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物及耐藥性監(jiān)測工作的開展具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 2010年9月自新疆某規(guī)?；i場（養(yǎng)殖場分布于呼圖壁和昌吉等地）采集豬肛拭糞樣分離出豬源大腸埃希菌454株。2010年9月自新疆昌吉某規(guī)?；驁霾杉蚋厥眉S樣分離出羊源大腸埃希菌638株。2012年9月～10月自新疆南北疆牛場采集牛肛拭糞樣分離出牛源大腸埃希菌89株。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC25922為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、普通肉湯和Mueller－Hinton（MH）培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)藥品 喹諾酮類：環(huán)丙沙星（含量100%）、諾氟沙星（含量99.6%）和恩諾沙星（含量100%）；β－內(nèi)酰胺類：頭孢噻呋（含量100%）、氨芐西林（含量86.5%）和阿莫西林（含量86.6%）／克拉維酸（含量100%）；氨基糖苷類：安普霉素（含量55.8%）、阿米卡星（含量65.5%）、慶大霉素（含量54.6%）；酰胺醇類：氟苯尼考（含量99.2%）。上述藥品均為標(biāo)準(zhǔn)品，為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌分離鑒定方法 按臨床常用細(xì)菌分離鑒定方法，將采集的沾有樣品的肛拭子放入內(nèi)含1mL滅菌營養(yǎng)肉湯的2mL EP管中，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)12h，用接種環(huán)將樣液在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上劃線，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)18h～24h后，挑取平板上紫黑色、有金屬光澤的單菌落，在麥康凱瓊脂平板上劃線，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)18h～24h后，平板上生長出一致的粉紅色菌落，為大腸埃希菌，挑取單菌落，保存?zhèn)溆?。疑似菌株?jīng)革蘭染色及生化鑒定后，確定為大腸埃希菌的保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)及其判定方法 根據(jù)對各養(yǎng)殖場進(jìn)行用藥調(diào)研，選取各養(yǎng)殖場常用抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中豬源與羊源菌未進(jìn)行氨基糖苷類慶大霉素的測定，而是選取酰胺醇類氟苯尼考測定，牛源相反。按CLSI推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行，對分離的不同動(dòng)物源大腸埃希菌進(jìn)行上述藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）值測定，結(jié)果判定參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)CLSI標(biāo)準(zhǔn)。以ATCC25922菌株作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控，其對被檢抗菌藥物的MIC均在質(zhì)控范圍內(nèi)，且陽性對照肉湯長菌，陰性對照肉湯清亮，MIC結(jié)果真實(shí)可信。判斷結(jié)果分別以敏感、中介和耐藥3種形式記錄結(jié)果，具體判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1［3－4］。

表1 抗菌藥物的MICs結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The MICs criteria of antimicrobial agents μg／mL

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌的分離鑒定結(jié)果

大腸埃希菌是共生菌，易于分離，大腸埃希菌分離率見表2。從豬場采集的543份糞樣中分離出454株大腸埃希菌（83.6%），從羊場采集的780份糞樣中分離出638株大腸埃希菌（81.8%），從牛場采集的90份糞樣中分離出89株大腸埃希菌（98.9%）。其中牛糞樣分離率最高。

表2 不同動(dòng)物源大腸埃希菌的分離情況Table 2 The isolation of E.coli in different animals

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同地區(qū)動(dòng)物源大腸埃希菌耐藥結(jié)果 藥敏結(jié)果顯示，各地區(qū)不同動(dòng)物源大腸埃希菌對常用抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥情況各不相同，豬源呼圖壁地區(qū)耐藥情況均較嚴(yán)重，牛源不同地區(qū)以昭蘇、新合和拜城地區(qū)的耐藥較為嚴(yán)重，對常用的10種抗生素，各地區(qū)豬源與牛源大腸埃希菌均對氨芐西林耐藥較為嚴(yán)重，羊源大腸埃希菌對安普霉素的耐藥較高（表3）。

2.2.2 不同動(dòng)物源大腸埃希菌耐藥率結(jié)果比較由圖1可知，豬源大腸埃希菌對氨芐西林、阿莫西林／克拉維酸、氟苯尼考和恩諾沙星的耐藥較為嚴(yán)重，耐藥率均在40%以上；羊源大腸埃希菌對安普霉素和阿莫西林／克拉維酸耐藥率較高，分別為33.9%和21.2%；牛源大腸埃希菌對氨芐西林耐藥率較高為24.4%，對其他被檢抗生素的耐藥率都在10%以下。

2.2.3 不同動(dòng)物源大腸埃希菌中介率結(jié)果比較由圖2可知，豬源大腸埃希菌對恩諾沙星的中介率較高為25.8%，對氨芐西林的中介率僅1.1%，對其他被檢抗菌藥物的中介率均在5%左右；羊源大腸埃希菌對氨芐西林、阿米卡星和恩諾沙星的中介率較高，均在15%以上；牛源大腸埃希菌對阿莫西林／克拉維酸的中介率較高僅10.0%、對其他被檢藥物的中介率均在3%以下，被檢藥物中安普霉素、氟苯尼考、慶大霉素?zé)o中介值。

2.2.4 不同動(dòng)物源大腸埃希菌敏感率結(jié)果比較由圖3可知，豬源大腸埃希菌對頭孢噻呋、阿米卡星、環(huán)丙沙星的敏感率均在70.0%以上；羊源大腸埃希菌對氟苯尼考、諾氟沙星、頭孢噻呋、環(huán)丙沙星的敏感率分別為96.9%、88.9%、84.5%、81.3%，均在80.0%以上；牛源大腸埃希菌對安普霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻呋、阿莫西林／克拉維酸、氨芐西林敏感率依次為：98.9%、97.8%、97.8%、97.8%、97.8%、95.6%、92.2%、81.1%和72.2%。

2.2.5 不同動(dòng)物源菌多藥耐藥結(jié)果 由圖4可知，豬源大腸埃希菌2耐～5耐為主，占78.2%，多藥耐藥菌株中以3耐（20.7%）居多，0耐不足10%，9耐菌株占0.2%；羊源大腸埃希菌以0耐～2耐為主，占79.9%，0耐菌株占34.3%，僅1株9耐（0.2%）菌株；牛源大腸埃希菌0耐～1耐為主，占90.0%，0耐（64.4%）居多，僅1株（1.1%）5耐菌株。

表3 不同地區(qū)動(dòng)物源大腸埃希菌耐藥結(jié)果Table 3 The drug resistance results of E.coli in animals of different districts

圖1 不同動(dòng)物源大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物耐藥情況Fig.1 The antimicrobial drug resistance of E.coli isolates from different animals

圖2 不同動(dòng)物源大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的中介情況Fig.2 The antimicrobial drug resistance intermediary of E.coli isolates from different animals

圖3 不同動(dòng)物源大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的敏感情況Fig.3 The antimicrobial drug sensitiveities of E.coli isolates from different animals

圖4 不同動(dòng)物源大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物多重藥耐藥情況Fig.4 The multidrug resistance of E.coli isolates from different animals

2.2.6 不同動(dòng)物源菌耐藥分型結(jié)果 結(jié)果見表4。豬源大腸埃希菌對所檢測的9種抗菌藥物存在148種耐藥表型，多藥耐藥菌株中以 A／C／AMP／FFC（35株）、A／C／AMP（28株）、AMP（14株）表型居多，羊源大腸埃希菌對所檢測的9種抗菌藥物存在101種耐藥表型，多藥耐藥菌株中以APR（62株）、AMK（44株）、APR／AMK（40株），牛源大腸埃希菌對所檢測的9種抗生素存在11種耐藥表型，多藥耐藥菌株中以 AMP（14株）、A／C／AMP（4株）表型居多。

3 討論

3.1 不同動(dòng)物源大腸埃希菌對被檢藥物耐藥情況比較

不同動(dòng)物源大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除氨芐西林外，對臨床常用抗菌藥物的耐藥率呈豬源菌＞羊源菌＞牛源菌，值得注意的是豬源菌對于使用時(shí)間不長的動(dòng)物專用廣譜抗生素氟苯尼考耐藥率已達(dá)41.2%。對阿米卡星的耐藥率已達(dá)到19.8%，阿米卡星為半合成的氨基糖苷類藥物，對多數(shù)氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定［5］，因其價(jià)格高，獸醫(yī)臨床用藥頻率低，然而已經(jīng)產(chǎn)生不可小覷的耐藥率；中介結(jié)果可以看出，豬源大腸埃希菌對喹諾酮類藥物恩諾沙星的中介率最高，而羊源菌在β－內(nèi)酰胺類氨芐西林及氨基糖苷類藥物阿米卡星的中介值也都較高，提示如繼續(xù)使用該類藥物在短期內(nèi)可能有升高的風(fēng)險(xiǎn)，迅速增加對該藥耐受的細(xì)菌數(shù)量，致使該類藥物臨床治療失??；通過敏感性比較可知，牛源菌對被檢共同藥物的敏感性顯著高于豬源菌與羊源菌，敏感率較高的抗菌藥物提示在未來使用中占優(yōu)勢，或起到好的治療作用。牛源菌對此次單獨(dú)檢測的慶大霉素的敏感性顯著高于其他動(dòng)物源［6－7］。

我國各地區(qū)對于豬源大腸埃希菌耐藥性檢測較多，不同地區(qū)耐藥情況有相當(dāng)大的差異。戴秀美等［8］對我國不同地區(qū)豬源大腸埃希菌耐藥性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，廣東對阿莫西林、氨芐青霉素、慶大霉素耐藥率為100%；湖南豬源大腸埃希菌對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、頭孢噻呋、安普霉素和慶大霉素的耐藥率分別為86.2%、72.4%、74.1%、51.7%、5.2%和63.8%；哈爾濱豬源大腸埃希菌對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林／克拉維酸、氨芐西林、頭孢噻呋和慶大霉素的耐藥率分別為 76.3%、68.8%、97.5%、97.5%、81.3%和62.5%。此外，四川、皖西地區(qū)等全國大部分地區(qū)豬源大腸埃希菌對抗菌藥物耐藥程度明顯高于新疆豬源大腸埃希菌。與豬源，牛源大腸埃希菌耐藥程度調(diào)查較少，余婷等［9］報(bào)道寧夏地區(qū)66株牛源大腸埃希菌對慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星耐藥率分別為40.9%、15.2%、6.1%、7.6%和19.7%，其耐藥率高于本次被檢藥物；薛原等［10］報(bào)道哈爾濱地區(qū)48株奶牛源大腸埃希菌對阿莫西林／克拉維酸鉀的耐藥率達(dá)97.92%，慶大霉素耐藥率＞10%，均高于本次所檢藥物，安普霉素耐藥率與本次被檢相近。羊源菌的耐藥調(diào)查鮮見報(bào)道，本次僅對某一養(yǎng)殖場進(jìn)行羊源大腸埃希菌耐藥初探，采集數(shù)量較多，有一定的局限性，僅代表該養(yǎng)殖的耐藥情況。今后需進(jìn)一步擴(kuò)大樣品采集的范圍和數(shù)量，從而更加全面地反應(yīng)新疆動(dòng)物源大腸埃希菌的耐藥水平。

表4 不同動(dòng)物源大腸埃希菌主要的耐藥表型Table 4 The main drug resistance phenotype of E.coli isolates from different animals

3.2 不同動(dòng)物源大腸埃希菌對被檢抗菌藥物多藥耐藥性比較

通過多藥耐藥比較可知，對臨床常用抗菌藥物的多藥耐藥水平呈豬源菌＞羊源菌＞牛源菌。不同動(dòng)物源多藥耐藥表型分型結(jié)果顯示，豬源大腸埃希菌耐藥分型主要以3耐為主，耐藥分型復(fù)雜，含有148種耐藥表型，羊源大腸埃希菌耐藥分型主要以2耐為主，牛源大腸埃希菌耐藥分型主要以1耐為主，此外，豬源和牛源大腸埃希菌耐藥分型都以AMP、A／C／AMP、A／C／AMP／FFC分型較多，羊源大腸埃希菌主要以APR、AMK、APR／AMK分型較多，不同動(dòng)物源大腸埃希菌多藥耐藥表型復(fù)雜，造成這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是菌株長期處于多種抗菌藥物的選擇壓力下，致使細(xì)菌的耐藥性通過染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)在細(xì)菌間傳播和擴(kuò)散，致使正常大腸埃希菌對藥物環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng)，不同耐藥基因在細(xì)菌間的相互傳遞和蔓延，因而可導(dǎo)致多藥耐藥性廣泛流行。另據(jù)研究報(bào)道，多藥耐藥菌株的大量出現(xiàn)，可能是菌體細(xì)胞膜通透性的改變和細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)的超量表達(dá)共同作用的結(jié)果［11］。多藥耐藥性的增加必然會(huì)導(dǎo)致聯(lián)合用藥的效果降低，從而影響臨床治療效果，增加治療成本。

就新疆本地而言，豬源、羊源和牛源大腸埃希菌對被檢抗菌藥物的耐藥性有較大差異。根據(jù)用藥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬在免疫接種時(shí)或感染寄生蟲時(shí)持續(xù)使用抗菌藥物，且飼料中常常添加抗菌藥物來促生長和預(yù)防疾病。而對于牛羊養(yǎng)殖，新疆集約化養(yǎng)殖程度低，多采用放牧和舍飼，自然抵抗力較強(qiáng)，用藥少且頻率低，有文獻(xiàn)報(bào)道［12］自然放牧的畜牧業(yè)比集約化養(yǎng)殖場的耐藥情況要低，自由放牧和減少抗菌藥物的使用可能在某種程度上減少抗菌藥物耐藥的發(fā)生。另外，牛的獸醫(yī)臨床常采用有較好治療效果的物理療法或中藥控制疾?。ㄈ缛榉垦椎龋?3］。本試驗(yàn)結(jié)果與國內(nèi)許多研究結(jié)果存在一定的相似性，與我國大部分地區(qū)一樣，新疆豬源、羊源、牛源大腸埃希菌對臨床上長期使用的氨芐西林、阿莫西林／克拉維酸的耐藥率較高。有研究表明［14］細(xì)菌的耐藥性與抗菌藥物選擇壓力密切相關(guān)，隨著抗菌藥物選擇壓力的增強(qiáng)，無論是大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥率還是多藥耐藥率都在不斷增大。抗菌藥物的用量和頻率的不同是引起動(dòng)物源大腸埃希菌耐藥差異的重要原因。

因此，有必要對大腸埃希菌進(jìn)行定期的藥物敏感性監(jiān)測，實(shí)時(shí)追蹤和掌控大腸埃希菌的耐藥性，以便制定合理的用藥方案，以最大限度的降低細(xì)菌耐藥率和延長抗菌藥物的療效周期。臨床治療細(xì)菌性疾病時(shí)，應(yīng)考慮停用動(dòng)物已經(jīng)產(chǎn)生耐藥的藥物，更換其它敏感的抗菌藥物作為治療藥物。對于某些中介率較高的藥物，用藥時(shí)要有足夠劑量和療程。獸醫(yī)臨床中，還要注意交叉用藥或聯(lián)合用藥，不能一味使用新藥，也可適時(shí)選擇中獸藥或食療等方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的治療方法。此外，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理，改善衛(wèi)生條件，提前做好預(yù)防接種。

新疆不同動(dòng)物源大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性呈現(xiàn)不同程度的耐藥，但總體低于我國其它地區(qū)耐藥水平，豬源大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物耐藥情況最嚴(yán)重，羊源菌次之，牛源菌耐藥水平最低。

豬源大腸埃希菌多藥耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，豬場應(yīng)慎重使用上述被檢各類抗菌藥物。

［1］夏利寧，趙紅瓊，蘇 艷，等.新疆某豬場分離的大腸埃希菌對抗生素耐藥性調(diào)查［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，49（12）：2299－2303.

［2］Dhillon R H，Clark J.ESBLs：A clear and present danger？［J］.Critical Care Research and Practice，2012（10）：1－11.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；seventeenth informational supplement［S］.CLSI document M100－S17，Wayne，Pennsylvania，2007：1－173.

［4］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals；apprpved standard－third edition.informational supplement［S］.CLSI document M31－A3，Wayne，Pennsylvania，2008.

［5］林居純，岳飛利，李 杰，等.雞源大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素耐藥性檢測［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（4）：90－91.

［6］田國寶，王紅寧，張安云，等.規(guī)?；i場大腸埃希菌β－內(nèi)酰胺類藥物耐藥性檢測及其超廣譜β－內(nèi)酰胺酶調(diào)查［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（10）：776－780.

［7］李不學(xué)，王建鋒，杜 軍，等.致仔豬腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.當(dāng)代畜牧，2013，8（4）：16－18.

［8］戴秀美，常維山.2012年我國部分地區(qū)豬源大腸埃希菌耐藥性分析［J］.畜禽業(yè)，2013（1）：50－52.

［9］余 婷，謝 敏，冀智佩，等.寧夏地區(qū)牛源大腸埃希菌ESBLs檢測及耐藥性分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（3）：25－28.

［10］薛 原，陳建飛，張秀英，等.奶牛大腸埃希菌耐藥性的監(jiān)測與分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（11）：115－116.

［11］Sun Jingjing，Deng Ziqing，Yan Aixin.Bacterial multidrug efflux pumps：Mechanisms，physiology and pharmacological exploitations［J］.Biochem Biophys Res Commu，2014，14（5）：1－14.

［12］Li Peng，Wu Dongfang，Liu Kunyao，et al.Investigation of antimicrobial resistance inEscherichiacoliand enterococci isolated from tibetan pigs［J］.PLoS One，2014，9（4）：1－16.

［13］楊 帆，楊玉榮，趙振升，等.中草藥消除細(xì)菌耐藥性質(zhì)粒研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：160－164.

［14］Tadesse D A，Zhao S H，Tong E，et al.Antimicrobial drug resistance inEscherichiacolifrom humans and food animals，United States，1950－2002［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（5）：741－749.