利用類(lèi)病毒脂質(zhì)體抗原檢測(cè)H5N1亞型禽流感病毒抗體ELISA方法的建立

楊 倩，朱道中，薛春宜，李曉明，曹永長(zhǎng)＊，段燕喻，王 瑩，吳曉薇，劉志玲

（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623；3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬的流感病毒引起的一種禽類(lèi)重要傳染性疫病。該病于1878年首次報(bào)道于意大利，自從1959年高致病性AI首次報(bào)道以來(lái)，全世界共暴發(fā)了32次，每次都給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失，其中較為受關(guān)注的有1959年英格蘭H5N1亞型AI、1994年墨西哥AI、1997年香港AI、2004年亞洲 H5N1亞型AI及2013年倍受關(guān)注的H7N9亞型AI事件［1］。該病影響范圍大，對(duì)人、畜、禽的健康均構(gòu)成了極大的威脅。目前根據(jù)禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）致病性的不同，可分為高致病性AIV、低致病性AIV和非致病性AIV 3大類(lèi)。迄今為止，高致病性AI基本是由H5亞型或H7亞型AIV引發(fā)的［2］。為了有效地防控AI，國(guó)內(nèi)外政府與學(xué)者給予了該病極大的關(guān)注。

AIV的一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白血凝素（HA）是大小為75ku的糖蛋白，具有凝集部分動(dòng)物紅細(xì)胞的功能，是主要的表面抗原?；|(zhì)蛋白（M）包括2個(gè)蛋白M1和M2，其中M1蛋白是病毒顆粒的主要組分，與病毒的組裝和出芽相關(guān)［3］。病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）是含有特定病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，內(nèi)部不含病毒核酸物質(zhì)，在形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小上與真實(shí)的病毒粒子類(lèi)似，具有與完整病毒類(lèi)似的免疫原性和免疫反應(yīng)性［4］。流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白可以相互作用，形成流感VLP。本研究的VLP是利用流感病毒HA和M1兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白形成的。

對(duì)于流感病毒VLP的應(yīng)用主要在疫苗研制領(lǐng)域和免疫測(cè)定領(lǐng)域。在疫苗研制方面，因?yàn)閂LP疫苗既避免了病毒的感染性，又具有疫苗的有效預(yù)防的可能性，因此較為理想?，F(xiàn)已報(bào)道的有H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H5N3及 H9N2亞型流感病毒VLP，動(dòng)物試驗(yàn)證明這些流感病毒VLP可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)?，F(xiàn)階段研究表明，流感病毒VLP疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的免疫效價(jià)，并且可誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，同時(shí)不含核酸安全性較高。但目前研究大多停留在動(dòng)物試驗(yàn)和臨床前試驗(yàn)的階段?，F(xiàn)在VLP在免疫測(cè)定中也有了一定得應(yīng)用，主要包括在抗體檢測(cè)的應(yīng)用和抗原檢測(cè)的應(yīng)用。

傳統(tǒng)意義上的脂質(zhì)體亦稱(chēng)類(lèi)脂小球，它是由磷脂雙分子定向排列而成的，其直徑約為幾微米至幾毫米，是人工制備的顆粒，其組成包括不溶性的極性的磷脂質(zhì)和膽固醇等附加劑。由于其制備簡(jiǎn)單、安全性高、靶向性高、無(wú)免疫原性反應(yīng)等受到人們的廣泛重視。利用重組桿狀病毒感染宿主細(xì)胞，病毒大量出芽后，會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，破碎的細(xì)胞因疏水作用而形成“球狀”，將其稱(chēng)為類(lèi)病毒脂質(zhì)體?，F(xiàn)在關(guān)于類(lèi)病毒脂質(zhì)體的研究還停留在初期階段，因此希望進(jìn)行更加深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞和培養(yǎng)基 重組的 A／Harbin／Re-1／2003（H5N1Re-1）滅活禽流感病毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所贈(zèng)送，含有 A／goose／Guangdong／1／96（H5N1）的HA和NA片段，其他6個(gè)片段來(lái)自A／Puerto Rico／8／1934（H1N1）。

pFastBacDual-HA和pFastBacDual-HA-M1質(zhì)粒和Sf9細(xì)胞由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；Grace培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品；Sf-900ⅡSFM 為GIBCO公司產(chǎn)品。

1.1.2 ELISA所用試劑和器材 包被緩沖液，洗滌緩沖液，封閉液，稀釋緩沖液，底物緩沖液，顯色緩沖液，終止液；96孔平底聚苯乙烯酶標(biāo)板為Greiner公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組桿狀病毒的構(gòu)建 將pFastBacDual-HA和pFastBacDual-HA-M1轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10β感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)，然后經(jīng)藍(lán)斑篩選和抗生素篩選，獲得相應(yīng)質(zhì)粒并利用PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)座質(zhì)粒（rBacmid）進(jìn)行鑒定。參考Invitrogen公司Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)手冊(cè)，將質(zhì)粒（rBacmid-HA、rBacmid-HA-M1）和 Cellfectin?Ⅱ Reagent脂質(zhì)體混合，接種于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，然后置于28℃培養(yǎng)5h后，棄去原混合物并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌2次，然后加入Grace完全培養(yǎng)基，28℃繼續(xù)培養(yǎng)72h，收獲培養(yǎng)基和細(xì)胞，上清即為P1代重組病毒，4℃保存?zhèn)溆?。用P1重組病毒感染Sf9細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，蝕斑鑒定種毒滴度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 H5N1亞型 AIV VLP的制備、純化和鑒定 將純化后的重組桿狀病毒rBacmid-HA-M1以5mol感染昆蟲(chóng)細(xì)胞。28℃，培養(yǎng)72h后，收獲上清。10 000r／min、4℃離心30min，收集上清液，然后將上清液，40 000r／min、4℃離心2h，收集沉淀用PBS重懸。將PBS重懸液上樣于200g／L～600g／L梯度蔗糖液面上，27 000r／min、4 ℃離心2h，吸取病毒條帶，然后40 000r／min、4℃離心1h脫糖，用適量PBS重懸沉淀。通過(guò)血凝試驗(yàn)檢測(cè)獲得的純化的AIV VLP的血凝活性，通過(guò)透射電鏡觀(guān)察形態(tài)，鑒定是否與真實(shí)流感病毒顆粒具有相似的構(gòu)象。

1.2.3 H5N1亞型AIV類(lèi)病毒脂質(zhì)體的制備和鑒定 將純化后的重組桿狀病毒rBacmid-HA-M1以5mol感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，28℃培養(yǎng)72h后，收獲細(xì)胞。將細(xì)胞用PBS洗滌3次，離心后取沉淀。將沉淀用200μL預(yù)冷的PBS重懸，反復(fù)凍融3次后在冰水浴中采用超聲波破碎30min，然后靜置10min，最后3 000r／min離心5min，取上清進(jìn)行鑒定。鑒定方法同VLP。

1.2.4 H5N1亞型AIV HA蛋白的制備和鑒定將純化后的重組桿狀病毒rBacmid-HA以MOI為5感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，28℃，培養(yǎng)72h后，收獲細(xì)胞。將細(xì)胞用PBS洗滌3次，離心后取沉淀。向沉淀加入200μL細(xì)胞裂解液，混勻，然后在冰上靜置30min，3 000r／min離心5min，取上清。通過(guò)SDS-PAGE和血凝試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.2.5 最適抗原包被濃度和對(duì)照血清最佳稀釋度的確定 以單獨(dú)表達(dá)的HA蛋白、類(lèi)病毒脂質(zhì)體、VLP分別作為抗原進(jìn)行包被。采用方陣試驗(yàn)確定最適抗原包被濃度和血清最佳稀釋度。抗原用包被液進(jìn)行稀釋?zhuān)?00μL含抗原量分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120ng，然后分別加入酶標(biāo)板內(nèi)，100μL／孔，4℃包被過(guò)夜；洗滌后用封閉液37℃封閉1h；再次洗滌后，將陰、陽(yáng)性血清用稀釋液分別作1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀釋?zhuān)尤胂鄳?yīng)的孔內(nèi)，100μL／孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，37℃溫育1h；用洗滌液洗滌3次，然后加入驢抗雞IgG-HRP（1∶5 000稀釋?zhuān)?00μL／孔，37 ℃溫育1h；再次洗滌后加顯色液，100L／孔，37℃溫育10min，2mol／L H2SO4終止，50μL／孔，將酶標(biāo)板置于450nm處讀取OD值。取陽(yáng)性血清孔的OD值接近1.0，陰性血清孔OD值小于0.2，P／N最大的血清稀釋度作為抗原及血清的最適工作濃度。

1.2.6 間接ELISA臨界值的判定 間接ELISA方法的判定標(biāo)準(zhǔn)：取3種抗原樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)。當(dāng)（樣品OD450nm值-空白對(duì)照OD450nm值）／（陰性對(duì)照OD450nm值-空白對(duì)照OD450nm值）≥2.1時(shí)為陽(yáng)性［5］。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 采用試驗(yàn)建立的間接ELISA方法，分別用VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和滅活的H5N1亞型AIV作為抗原對(duì)H1N1亞型流感病毒陽(yáng)性血清、H3N2亞型流感病毒陽(yáng)性血清、H9N2亞型流感病毒陽(yáng)性血清、新城疫陽(yáng)性血清以及H5N1亞型AIV陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。

1.2.8 敏感性試驗(yàn) 取3份H5N1亞型AIV陽(yáng)性血清，進(jìn)行系列稀釋后，分別采用VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和滅活的H5N1亞型AIV作為抗原進(jìn)行檢測(cè)，記錄各陽(yáng)性血清在不同方法的檢測(cè)終點(diǎn)（陽(yáng)性反應(yīng)最高稀釋度），比較對(duì)同一組樣品的檢測(cè)靈敏度（最高稀釋度）。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取H5N1亞型AIV陽(yáng)性血清和陰性血清各1份，用3個(gè)不同時(shí)間制備的VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體、HA蛋白作為抗原進(jìn)行3次檢測(cè)，分別計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。

1.2.10 保存穩(wěn)定性試驗(yàn) 將包被用的抗原凍干成粉末，分別取置于37℃前、置37℃后4d和8d的樣品，按相同方法檢測(cè)同一份陽(yáng)性和陰性血清，比較前后3個(gè)時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.11 臨床樣品檢測(cè) 用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法對(duì)100份疑似H5N1亞型AIV陽(yáng)性的血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.12 血凝抑制試驗(yàn) 分別用VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體和滅活H5N1亞型AIV制備4單位抗原。參照《禽流感檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN／T1182—2010）［6］中的血凝抑制試驗(yàn)方法對(duì)30份陽(yáng)性血清及1份SPF雞陰性血清分別進(jìn)行HI抗體檢測(cè)，比較不同抗原所測(cè)得的HI抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 抗原的鑒定

2.1.1 血凝試驗(yàn)

2.1.1.1 VLP的血凝試驗(yàn) 血凝試驗(yàn)結(jié)果表明，10μg純化的VLP的HA效價(jià)為256，具有很強(qiáng)的凝集雞紅細(xì)胞的能力，說(shuō)明HA組裝入VLP-HAM1以后，仍然保持血凝活性和正確的空間構(gòu)象。

2.1.1.2 類(lèi)病毒脂質(zhì)體的血凝試驗(yàn) 血凝試驗(yàn)結(jié)果表明，10μg類(lèi)病毒脂質(zhì)體的HA效價(jià)為256，具有很強(qiáng)的凝集雞紅細(xì)胞的能力，說(shuō)明禽流感病毒類(lèi)病毒脂質(zhì)體有較高的血凝活性。

2.1.2 電鏡觀(guān)察

2.1.2.1 透射電鏡觀(guān)察病毒樣顆粒的形態(tài) 從圖1可以看出，表達(dá)的HA和M1形成的VLP直徑80nm～120nm，有明顯的刺突結(jié)構(gòu)（HA蛋白），與流感病毒粒子相似。

圖1 H5N1AIV VLP電鏡觀(guān)察結(jié)果Fig.1 Observation of influenza H5N1AIV VLP by electron microscopy

2.1.2.2 透射電鏡觀(guān)察類(lèi)病毒脂質(zhì)體的形態(tài) 從圖2可以看出，形成的類(lèi)病毒脂質(zhì)體直徑約為20nm～30nm，呈球狀。

圖2 H5N1AIV類(lèi)病毒脂質(zhì)體電鏡觀(guān)察結(jié)果Fig.2 Observation of influenza H5N1AIV virus-like liposomes by electron microscopy

2.1.3 重組HA的SDS-PAGE鑒定 HA基因大小為1 760bp，編碼一條由568個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子質(zhì)量約為70ku。重組桿狀病毒rBacmid-HA感染Sf9細(xì)胞72h后，收獲細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后裂解，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，可以檢測(cè)到表達(dá)的HA（圖3）。

圖3 HA蛋白SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant HA protein expression

2.2 抗原最佳包被濃度與對(duì)照血清最佳稀釋度的確定

通過(guò)方陣試驗(yàn)確定抗原最佳包被濃度為100ng／孔，H5N1亞型AIV血清最佳工作濃度為1∶500，二抗最佳稀釋度為1∶5 000。

2.3 間接ELISA臨界值的判定結(jié)果

通過(guò)隨機(jī)取抗原樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照于450nm下的OD值的平均值為0.120，空白對(duì)照的OD值的平均值為0.047。

2.4 特異性試驗(yàn)

采用VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和滅活H5N1亞型AIV分別作為抗原對(duì)H1N1、H3N2、H9N2亞型流感病毒陽(yáng)性血清、新城疫陽(yáng)性血清及H5N1亞型AIV陰性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)H5N1亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。但是VLP作為抗原對(duì)H1N1亞型流感病毒陽(yáng)性血清、H3N2亞型流感病毒陽(yáng)性血清、H9N2亞型流感病毒陽(yáng)性血清均為陽(yáng)性，故無(wú)法區(qū)分不同亞型的流感病毒。結(jié)果如表1。

表1 不同抗原的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of specificity test with different antigens

2.5 敏感性試驗(yàn)

分別以HA蛋白、VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體和滅活的H5N1亞型AIV作為抗原，檢測(cè)3份不同稀釋度的H5N1亞型AIV陽(yáng)性血清，結(jié)果表明HA重組蛋白的敏感性稍低于其他3種物質(zhì)作為抗原的敏感性，結(jié)果如表2。

表2 四種抗原的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of sensitivity test with four kinds of antigens

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

以3個(gè)不同時(shí)間制備的VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體、HA蛋白作為抗原進(jìn)行3次檢測(cè)，獲得的批內(nèi)和批間系數(shù)均小于10%，結(jié)果表明用3種抗原建立的檢測(cè)方法重復(fù)性均較好（表3和表4）。

表3 批內(nèi)變異系數(shù)Table 3 The results of variation co-efficient within batch

表4 批間變異系數(shù)Table 4 The results of variation co-efficient between batchs

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

比較前后3次檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明無(wú)顯著差異（只列出其中一組數(shù)據(jù)）。按37℃放置1d相當(dāng)于4℃放置1.6個(gè)月計(jì)算［5］，該試劑盒在4℃下至少可以穩(wěn)定保存1年。結(jié)果如表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of stability tests

2.8 臨床樣品檢測(cè)

利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法對(duì)100份疑似H5N1亞型AIV陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)。用類(lèi)病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和用滅活的H5N1亞型AIV作為抗原的方法，陽(yáng)性檢出率均為100%，而以VLP為抗原的方法陽(yáng)性檢出率為98%。

2.9 血凝抑制試驗(yàn)

分別采用VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體和滅活的H5N1亞型AIV抗原對(duì)30份陽(yáng)性血清及1份SPF雞陰性血清進(jìn)行HI抗體滴度檢測(cè)，結(jié)果同一血清樣品用類(lèi)病毒脂質(zhì)體作為抗原和用滅活的H5N1亞型AIV作為抗原測(cè)定的抗體效價(jià)相差不超過(guò)1個(gè)滴度，同一血清樣品用VLP作為抗原和用滅活的H5N1亞型AIV作為抗原測(cè)定的抗體效價(jià)相差不超過(guò)2個(gè)滴度。總體而言，類(lèi)脂質(zhì)體與VLP相比較，具有更好的抗原性，更接近于滅活的H5N1亞型AIV，結(jié)果如表6。

表6 雞血清中HI滴度檢測(cè)結(jié)果Table 6 The detection results of HI titer in chicken sera

3 討論

通過(guò)一系列驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果表明制備的3種物質(zhì)中類(lèi)病毒脂質(zhì)體與滅活全病毒一樣，具有較好的免疫原性，但比滅活全病毒更安全，因此在抗體檢測(cè)方面具有更好的應(yīng)用前景。

目前，針對(duì)VLP的研究主要集中在疫苗的開(kāi)發(fā)，有些VLP疫苗已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床，如人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）四價(jià)VLP疫苗已經(jīng)獲得批準(zhǔn)并投放到市場(chǎng)［7］；乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的 VLP預(yù)防性疫苗也研制成功并獲準(zhǔn)投放到市場(chǎng)中［8］。除此以外，雞傳染性囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、引起重癥急性呼吸綜合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）的冠狀病毒等VLP的疫苗都有較為深入的研究與開(kāi)發(fā)［9］。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)禽流感也建立了一系列檢測(cè)方法，包括血凝抑制試驗(yàn)、ELISA、RT-PCR、熒光RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等［10-11］，但針對(duì)禽流感病毒抗體的檢測(cè)均采用的是滅活的AIV作為檢測(cè)抗原。

本研究分別制備了AIV VLP、類(lèi)病毒脂質(zhì)體和HA蛋白，尤其是VLP和類(lèi)病毒脂質(zhì)體均不含有病毒核酸，在形態(tài)上與真實(shí)的病毒相似，從而希望利用其特點(diǎn)在疫苗領(lǐng)域及檢測(cè)領(lǐng)域充分發(fā)揮其抗原抗體免疫反應(yīng)的作用［12-13］。通過(guò)采用上述3種抗原物質(zhì)分別包被酶標(biāo)板，建立了相應(yīng)的H5N1亞型AIV抗體ELISA檢測(cè)方法。特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，類(lèi)病毒脂質(zhì)體相對(duì)于VLP和HA蛋白而言，在檢測(cè)方面具有更為良好的表現(xiàn)，而VLP在特異性反應(yīng)中所表現(xiàn)的結(jié)果并不理想，原因可能是因?yàn)镸1蛋白較為保守，干擾了對(duì)流感病毒不同亞型的區(qū)別，類(lèi)病毒脂質(zhì)體由于只有HA蛋白的存在，因此能較好的體現(xiàn)其型特異性。此外，類(lèi)病毒脂質(zhì)體由于在形態(tài)上類(lèi)似于真實(shí)的病毒，故在敏感性方面優(yōu)于用傳統(tǒng)方法處理的單獨(dú)表達(dá)的HA蛋白。綜上所述，本研究以類(lèi)病毒脂質(zhì)體為基礎(chǔ)，成功地建立了一種檢測(cè)H5N1亞型AIV的ELISA方法，提示類(lèi)病毒脂質(zhì)體在免疫檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)具有良好的應(yīng)用前景，尤其是在重大人畜共患病免疫檢測(cè)方法研究中具有安全優(yōu)勢(shì)。

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