斑馬魚谷氨酸功能低下精神分裂行為模型的建立

顏 慧，宮澤輝

斑馬魚是一種小型亞熱帶淡水魚，因體側有銀藍色的縱向條紋而得名。斑馬魚具有近似人類的各種器官系統(tǒng)并且具有相似的功能，如心臟血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)，因此斑馬魚作為一種新型的模生物已廣泛用于研究脊椎動物的胚胎發(fā)育，而近年來隨著研究的深入，斑馬魚在疾病研究、藥物篩選及毒性試驗中的作用也逐漸引起關注［1－4］。

斑馬魚與神經(jīng)精神藥理相關的行為研究在國內外的進展不一，近幾年國外利用不同裝置針對斑馬魚的復雜行為表現(xiàn)建立了多種行為模型，如自發(fā)活動模型、新奇事物探索模型、黑/白箱偏愛模型等［5－9］，而國內目前尚未見系統(tǒng)性報道。

NMDA受體拮抗劑——地卓西平馬來酸鹽［(+)MK-801］是致動物精神分裂模型中常用的工具藥之一，能誘導動物產(chǎn)生活動增多、刻板行為、認知和感覺運動門控障礙、社會接觸能力損害等異常行為表現(xiàn)，這些表現(xiàn)與精神分裂癥的癥狀有某些一致性［10－11］。

本實驗利用自行設計斑馬魚行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)，觀察斑馬魚游泳行為，確定行為指標，用MK-801預處理建立藥物致谷氨酸功能低下精神分裂癥行為模型，并考察不同藥物對于斑馬魚行為的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 成年3～6個月斑馬魚，AB品系，♀♂不限，由軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所趙寶全博士惠贈。利用斑馬魚獨立養(yǎng)殖單元進行培養(yǎng)，每8條置于3 L水箱中，培養(yǎng)至少15 d以適應實驗環(huán)境。魚水由純凈水添加海鹽配制而成。室溫與水溫控制在(28±2)℃，光照自動控制(光照時間8:00～18:00)，正常喂食，每天兩次。所有的魚均為首次實驗。

1.2 材料 地卓西平馬來酸鹽，純度＞98%，日本W(wǎng)ako公司，批號:PEG1079，色譜級，以魚水配制濃度為3.4 mg·L－1;氯氮平(clozapine)，黃色粉末，純度＞90%，由軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所黃世杰教授惠贈，使用時先以1 mol·L－1鹽酸配制為 5 g·L－1母液，再以魚水稀釋;奧氮平(olanzapine)，美國Lily公司，批號:A689380，每片含奧氮平5 mg，使用時先研成粉末，而后加入0.1 mol·L－1鹽酸充分溶解，高速離心后取上清液，以加入的溶液總體積計算配制成4 g·L－1母液，再以魚水稀釋。

1.3 儀器 斑馬魚獨立養(yǎng)殖單元ESEN-AW-SS-1(北京愛生科技發(fā)展有限公司);斑馬魚游泳行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)(安來科技有限公司)。

1.4 動物分組與藥物處理 斑馬魚分為6組(n=8～10):正常組(斑馬魚在300 ml魚水中暴露1 h);MK-801組(魚在同體積含3.4 mg·L－1MK-801的水體中暴露1 h);氯氮平組(魚在同體積5 mg·L－1氯氮平的水體中暴露30 min);奧氮平組(魚在同體積 4 mg·L－1奧氮平的水體中暴露30 min);氯氮平預防組，在預防組中，魚在同體積5 mg·L－1氯氮平的水體中暴露30 min后，再轉入含3.4 mg·L－1MK-801的水體中處理1 h;奧氮平預防組，除了預先暴露于4 mg·L－1奧氮平外，其他操作同氯氮平預防組。

1.5 行為測試方法 測試方法參考文獻［5，12－13］并略加改進，行為測試裝置為1.5 L梯型魚箱(15.2 cm高×7.1 cm寬×27.9 cm頂面長×22.5 cm底面長)，行為測試時，魚箱最大程度地裝滿水，光照強度與之前的培養(yǎng)條件相同，每條魚放于測試箱中，分別從水平與垂直兩個方向視頻記錄游泳行為，分析首6 min的運動數(shù)據(jù)。利用視頻軟件將觀察箱垂直方向等分為上下兩個分區(qū)，水平方向等分為4個分區(qū)，記錄運動軌跡及各項運動指標。而后人工根據(jù)視頻資料分析統(tǒng)計不規(guī)則運動及呆滯動作頻率，作為反映斑馬魚行為的附加指標。

不規(guī)則運動的定義:在運動方向和(或)速度的急劇變化及重復的快速急進行為。呆滯行為的定義:除了鰓和眼活動外，完全不運動超過2 s。

1.6 統(tǒng)計學分析 利用GraphPad Prism 4軟件繪制曲線與統(tǒng)計學檢驗，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示。組間比較采用oneway ANOVA進行分析，Newman-Keuls test進行組間后檢驗。

2 結果

2.1 不同藥物對于斑馬魚運動軌跡的影響 Fig 1顯示不同條件下斑馬魚在觀察箱中6 min內的垂直方向的運動軌跡，正常情況下斑馬魚進入新環(huán)境后，多數(shù)會沿測試箱邊界表現(xiàn)明顯的探索興趣，從運動軌跡上可見正常組斑馬魚上下穿梭較頻繁，魚在箱壁附近活動較多。MK-801處理使得斑馬魚在上部的運動距離明顯增加，氯氮平有使斑馬魚穿梭減弱的趨勢，單獨給予奧氮平并不影響斑馬魚的運動軌跡，而藥物預防組中，會降低斑馬魚的穿梭次數(shù)，使魚的運動集中于上部。

Fig 1 Computerized video tracks of zebrafish behavior in the tank in first 6 min after exposed to different experimental challenges

2.2 不同藥物對于斑馬魚垂直方向運動的影響 藥物處理斑馬魚后的垂直運動方向的運動路程與穿越次數(shù)的變化如Fig 2所示。MK-801預處理組垂直運動路程比正常對照組增加32%(P＜0.05)，而氯氮平與奧氮平預處理組與正常組無變化;與MK-801組相比，氯氮平+MK-801組的垂直運動降低40%，奧氮平+MK-801組降低37%(P＜0.01)。

Fig 2 Total vertical travel distances and transitions of zebrafish in first 6 min(±s，n=8～10)A:Vertical travel distance(cm);B:Vertical transitions.Zebrafish was exposed to different experimental challenges in a pre-treatment beaker before being transferred into the tank for behavioral observation.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs the normal group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs the MK-801 group

MK-801預處理組垂直方向運動路程的增加，是由于魚在上半?yún)^(qū)的高速運動所產(chǎn)生的，與之對應的是與正常組相比，MK-801預處理組的垂直穿越次數(shù)下降約59%(P＜0.01)，氯氮平組下降約71%(P＜0.01)，而奧氮平組與正常組相比差異無顯著性;與MK-801組相比，氯氮平+MK-801組和奧氮平+MK-801組雖然差異無顯著性，但垂直穿越次數(shù)更加減少;與正常組相比，氯氮平+MK-801組的垂直運動降低87%，奧氮平+MK-801組降低90%(P＜0.01)。值得注意的是，單獨給予奧氮平并不引起垂直穿越的明顯變化，而一旦與MK-801合用，卻引發(fā)穿越次數(shù)非常明顯的下降。

2.3 不同藥物處理對于斑馬魚水平方向運動的影響 水平運動路程與水平穿越次數(shù)的變化規(guī)律一致(Fig 3)，與正常組相比，6 min內MK-801組的水平運動路程與穿越次數(shù)分別增加69%和47%(P＜0.01)，而氯氮平與奧氮平單獨預處理組與正常組無變化，而與MK-801組相比，氯氮平+MK-801組的水平運動路程減少33%(P＜0.01)，水平穿越次數(shù)降低43%(P＜0.01);與MK-801組相比，奧氮平+MK-801組的水平運動路程降低27%(P＜0.05)，水平穿越次數(shù)降低36%(P ＜0.01)。

Fig 3 Total horizontal travel distances and transitions of zebrafish in first 6 min(±s，n=8～10)A:Travel distance(cm);B:Horizontal transitions.＊＊P ＜0.01 vs the normal group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs the MK-801 group

2.4 不同藥物處理條件下斑馬魚異常行為指標的變化 在實驗中，同方向同區(qū)域連續(xù)轉3圈記為一次異常行為，急停、急轉一次記為一次異常行為。在MK-801預先處理組中，斑馬魚表現(xiàn)出持續(xù)在上半分區(qū)進行重復的高速轉圈、急停急轉等異常行為，與正常組相比差異有顯著性(P＜0.01)，氯氮平+MK-801組中，斑馬魚的運動速度減緩，轉圈行為減少，與MK-801組相比異常行為明顯改善(P＜0.01)，但與正常組相比，仍有明顯的急速轉身行為(P＜0.01);奧氮平+MK-801組中，斑馬魚運動速度未受影響，但仍有重復轉圈行為，在明顯降低MK-801引起的異常行為(P＜0.01)同時，與正常組相比差異有顯著性(P＜0.01)，見Fig 4。

Fig 4 Frequency of abnormal movements of zebrafish in first 6 min±s，n=8～10)＊＊P＜0.01 vs the normal group;##P＜0.01 vs the MK-801 group

3 討論

斑馬魚作為新的模式動物，在給予不同刺激條件下，其復雜的行為模式與精神神經(jīng)障礙行為相關性的研究已逐漸引起研究者的關注。根據(jù)文獻報道［5－9］，利用梯形測試箱，焦慮與恐懼、藥物依賴與戒斷等相關的行為指標已在斑馬魚模型中確定，其中上下穿梭次數(shù)、游泳速度與運動距離、呆滯與異常游泳動作是評價模型建立的主要指標。

本實驗用MK-801預處理后，從水平和垂直兩個方向觀測的結果均可看到斑馬魚的運動距離明顯增加，這與小鼠模型上的運動亢進相一致。MK-801引發(fā)的斑馬魚刻板轉圈與急沖急轉行為，與小鼠模型中小鼠的刻板轉圈跑動、突然沖撞相吻合。另外，MK-801處理后，斑馬魚表現(xiàn)為長時間在上部高速游泳，從定量指標反映為運動路程增加，垂直穿越次數(shù)降低，而這些指標在大小鼠等傳統(tǒng)造模動物上是無法獲取的。在國外研究斑馬魚行為模型中，垂直穿越次數(shù)減少是動物焦慮與抑郁行為的重要指標［12－14］。

實驗中選用的陽性藥氯氮平是第一個非經(jīng)典抗精神病藥物，其中樞作用機制較為復雜，除對5-HT2和DA受體的親和力較強外，還可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)受體而產(chǎn)生多相效應，在臨床表現(xiàn)出治療的廣譜性，同時也由于這種作用復雜性，在臨床上也出現(xiàn)矛盾效應，文獻報道［15］在動物模型上氯氮平加重共濟失調，這可能與其對膽堿能受體的拮抗作用相關。本試驗中觀察到氯氮平單藥也使斑馬魚垂直穿越次數(shù)減少，與MK-801合用可以緩解其引發(fā)的運動亢進、刻板行為增加等類似陽性癥狀的行為，但對垂直穿越行為幾乎完全抑制。這與氯氮平對精神分裂癥的陰性癥狀療效欠佳是一致的，我們分析可能與藥物的作用機制密切相關。

奧氮平是一種新開發(fā)的非經(jīng)典抗精神病藥物，對DA2受體的選擇性較強，單藥對斑馬魚的行為軌跡無明顯影響，但對MK-801所致的斑馬魚運動行為異常的干預作用與氯氮平相近，雖能緩解其運動亢進，但也抑制垂直穿越行為，推測與受體亞型的親合力不同相關，其確切機制有待進一步研究。

綜上，預先給予不同化合物會使斑馬魚的游泳行為發(fā)生變化，與大小鼠模型相比，斑馬魚對神經(jīng)系統(tǒng)藥物反應的靈敏度較高，從水平與垂直兩方向觀察到的行為指標可提供更多的信息，能較全面地反映藥物對動物行為的影響，另外，由于斑馬魚給藥方式簡單，需藥量少，模型建立成本低等特點，相信其行為模型會在神經(jīng)精神藥理學研究具有廣泛的應用前景。

［1］Grunwald J D，Eisen J S.Timeline:headwaters of the zebrafish － emergence of a new model vertebrate［J］.Nat Rev Genet，2002，3:717－24.

［2］Amsterdam A，Hopkins N.Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease［J］.Trends Genet，2006，22:473 －8.

［3］Lan C，Laurenson S，Copp B R，et al.Whole organism approaches to chemical genomics:the promising role of zebrafish(Danio rerio)［J］.Expert Opin Drug Discov，2007，2:1 －13.

［4］王思鋒，劉可春，王希敏，等.雷公藤紅素對斑馬魚胚胎心臟毒性的初步研究［J］.中國藥理學通報，2009，25(5):634 －6.

［4］Wang S F，Liu K C，Wang X M，et al.Preliminary study on cardiotoxicity of celastrol to zebrafish embryo［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(5):634 －6.

［5］Gerlai R，Lahav M，Guo S，Rosenthal A.Drinks like a fish:zebrafish(Danio rerio)as a behavior genetic model to study alcohol effects［J］.Pharmacol Biochem Behav，2000，67(4):773 －82.

［6］Mathur P，Guo S.Use of zebrafish as a model to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes［J］.Neurobiol Dis，2010，40:66 －72.

［7］Blank M，Guerim L D，Cordeiro R F，et al.A one-trial inhibitory avoidance task to zebrafish:Rapid acquisition of an NMDA-dependent long-term memory［J］.Neurobiol Learn Mem，2009，92:529 －34.

［8］Ninkovic J，Bally-Cuif L.The zebrafish as a model system for assessing the reinforcing properties of drugs of abuse［J］.Methods，2006，39:262 －74.

［9］Cachat J，Canavello P，Elegante M，et al.Modeling withdrawal syndrome in zebrafish［J］.Behav Brain Res，2010，208:371 －6.

［10］Olszewski R T ，Wegorzewska M M，Monteiro A C，et al.PCP and MK-801 induced behaviors reduced by NAAG peptidase inhibition via metabotropic glutamate receptors［J］.Biol Psychiatry，2008，63(1):86－91.

［11］Sun T，Hu G，Li M.Repeated antipsychotic treatment progressively potentiates inhibition on phencyclidine-induced hyperlocomotion，but attenuates inhibition on amphetamine-induced hyperlocomotion:Relevance to animal models of antipsychotic drugs［J］.Eur J Pharmacol，2009，602:334 －42.

［12］Bencan Z，Sledge D，Levin E D.Buspirone，chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety［J］.Pharmacol，Biochem Behav，2009，94:75 －80.

［13］Speedie N，Gerlai R.Alarm substance induced behavioral responses in zebrafish(Danio rerio)［J］.Behav Brain Res，2008，188:168 －77.

［14］Egana R J，Bergnera C L，Harta P C，et al.Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish［J］.Behav Brain Res，2009，205:38 － 44.

［15］蘇允愛，司天梅，周東豐，等.氯氮平對谷氨酸功能低下精神分裂癥小鼠模型的作用［J］.中華精神科雜志，2006，39(4):228－32.

［15］Su Y A，Si T M，Zhou D F，et al.Effects of clozapine one the hypoglutamatergic schizophrenia model in mice［J］.Chin J Psychiatry，2006，39(4):228 －32.