七氟醚和異氟醚對不同濃度羅庫溴銨抑制乙酰膽堿受體內(nèi)向電流的影響

劉 力，閔 蘇，魏 珂

羅庫溴銨(rocuronium，Roc)是臨床上常用的非去極化肌松劑，能與乙酰膽堿(acetylcholine)競爭性結(jié)合神經(jīng)肌接頭突觸后膜成人型乙酰膽堿受體(εnAChR)，阻斷神經(jīng)沖動傳導(dǎo)，發(fā)揮肌松作用。麻醉誘導(dǎo)時采用預(yù)注小劑量肌松劑來提高肌松起效時間，但不能增強(qiáng)肌松程度。揮發(fā)性吸入麻醉藥能夠明顯增強(qiáng)非去極化肌松劑的肌松作用，兩種藥物復(fù)合用于麻醉誘導(dǎo)能夠加快起效時間并提高肌松效果。本實驗通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立表達(dá)大鼠ε-nAChR的HEK293細(xì)胞模型［1］，比較兩種常用的揮發(fā)性吸入麻醉藥七氟醚(sevoflurane，Sev)和異氟醚(isoflurane，Iso)對不同濃度羅庫溴銨與ε-nAChR結(jié)合后內(nèi)向電流的影響，以闡明揮發(fā)性吸入麻醉藥復(fù)合不同劑量非去極化肌松劑的濃度效應(yīng)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 羅庫溴銨標(biāo)準(zhǔn)品，批號:X1-081201，由仙琚公司 (中國)提供。七氟醚、異氟醚購自美國雅培公司。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑分別購于美國Sigma公司和Invitrogen公司。

1.2 載體質(zhì)粒的構(gòu)建 從成年大鼠骨骼肌勻漿中提取 ε-nAChR 亞基 α、β、δ、ε 基因，分別插入原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒后通過測序鑒定，再亞克隆到真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1?；驕y序鑒定pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDNA3.1δ、pcDNA3.1ε 4 種載體質(zhì)粒連接正確(載體質(zhì)粒由廣州弗爾博生物公司構(gòu)建)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293細(xì)胞株(重慶醫(yī)科大學(xué)分子生物實驗室提供)在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司 含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清、1 ×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素、2 mmol·L－1谷氨酰胺)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)2～3 d和實驗前用0.25%胰酶消化傳代1次(密度為1×105)。

1.4 HEK293細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及功能鑒定 將pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDNA3.1δ、pcDNA3.1ε以2∶1∶1∶1比例與10 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國)混合，加Opti-MEM培養(yǎng)基至1 ml，孵育20 min后，加入HEK293培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)8 h后更換為DMEM培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h即行膜片鉗檢測。用空pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞作為陰性對照。不含目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，ACh(Sigma公司，美國)不能激發(fā)電流;而含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，ACh可激發(fā)電流。

1.5 揮發(fā)性吸入麻醉藥飽和灌流液的制備 50 ml的七氟醚或異氟醚(雅培公司，美國)加入到充滿400 ml灌流液的密封玻璃瓶中，在室溫下平衡24 h以上。通過氣相色譜儀(HP6890)測定濃度。

1.6 電生理記錄 用配置好的細(xì)胞外液(NaCl 140 mmol·L－1、KC1 5.4 mmol·L－1、CaCl21.8 mmol·L－1、MgCl 1.0 mmol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1、葡萄糖 11.1 mmol·L－1、阿托品 1 μmol·L－1，以NaOH調(diào)pH至7.4)替換細(xì)胞培養(yǎng)基，以1～2 ml·min－1速度灌注。電極內(nèi)液成分為CsC1 150 mmol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1、EGTA 5 mmol·L－1、Mg-ATP 2 mmol·L－1，以 CsOH 調(diào) pH 至7.3。用 PC-10微電極拉制儀(Narishige公司 日本)拉制微電極。電極電阻為2～5 MΩ。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄電流。電刺激脈沖的給出及電信號的采集通過digidatal 1200放大器(美國Axon Instruments公司)完成。采樣頻率1 000 Hz，低通Bessel濾波0.5 kHz。封接電阻大于1 GΩ時，吸破細(xì)胞膜成全細(xì)胞狀態(tài)。

1.7 分組和給藥方式 分別用6種不同濃度的羅庫溴銨標(biāo)準(zhǔn)品和七氟醚、異氟醚平衡溶液處理重組HEK293 細(xì)胞 30 s，再給予 100 μmol·L－1ACh，記錄峰電流。給肌松藥前后單用ACh激動受體，記錄的電流的平均值作為基礎(chǔ)值。給藥間隔2～3 min，并用細(xì)胞外液持續(xù)沖洗，以減少細(xì)胞脫敏感。擬合羅庫溴銨和七氟醚、異氟醚的量效曲線，得出3種藥物的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)。實驗根據(jù)羅庫溴銨的濃度分為 Roc(IC5)、Roc(0.5 IC50)、Roc(IC50)3大組，每組根據(jù)處理不同分為七氟醚組 (Sev組)和異氟醚組(Iso組)。各組用0.5 IC50的吸入麻醉藥水溶液處理重組細(xì)胞1 min后，分別用相應(yīng)濃度的羅庫溴銨處理細(xì)胞 30 s，給予 100 μmol·L－1ACh，記錄峰電流。各組以單純使用相應(yīng)濃度的羅庫溴銨為對照。

1.8 數(shù)據(jù)分析 采用Clampex和Clamfit軟件進(jìn)行電流圖形、數(shù)據(jù)處理。計量資料以±s表示。電流抑制率=1－［(測得峰電流/兩次給ACh后電流平均值)×100%］。量效曲線的擬合用Origin軟件(Microcal Software公司，美國)完成，其中IC50用Hill公式得出。統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件的單因素方差分析，組間比較用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 載體質(zhì)粒構(gòu)建鑒定 用ACh對含目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞、不含目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞激動受體的膜片鉗功能鑒定(Fig 1)。ACh只能激動含目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的內(nèi)向電流，而對空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和無轉(zhuǎn)染細(xì)胞無激動作用。

Fig 1 Acetylcholine(100μmol·L－1)induced currents in untransfected cell HEK293 cell transfected by non-target gene plasmid，and HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

2.2 羅庫溴銨、七氟醚和異氟醚對ε-nAChR抑制作用的量效關(guān)系 羅庫溴銨、七氟醚和異氟醚對重組HEK293細(xì)胞上 ε-nAChR的 IC50的值分別為:(150.45±12.5)μmol·L－1(95%置信區(qū)間115.70 μmol· L－1～ 185.19 μmol· L－1)。(824.27 ±14.73)μmol·L－1(95% 置信區(qū)間 783.36 μmol·L－1～865.17 μmol·L－1);(1031.53 ±62.91)μmol·L－1(95%置信區(qū)間 856.85 μmol·L－1～1206.22 μmol·L－1)。3種藥物對 ε-nAChR呈劑量依賴性的阻斷作用。其作用強(qiáng)度為羅庫溴銨＞＞七氟醚＞異氟醚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見Fig 2、3。

Fig 2 Concentration-effect curves of rocuronium for inhibition of acetylcholine-induced(100 μmol·L －1)currents in HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

Fig 3 Concentration-effect curves of isoflurane and sevoflurane for inhibition of acetylcholine-induced(100 μmol·L －1)currents in HEK293 cell expressing mouse adult-type muscle nicotinic acetylcholine receptors

2.3 濃度為0.5 IC50七氟醚、異氟醚預(yù)處理對3種不同濃度的羅庫溴銨抑制ε-nAChR內(nèi)向電流幅度的影響 用濃度為0.5 IC50的七氟醚、異氟醚溶液處理ε-nAChR后，羅庫溴銨抑制ACh誘發(fā)ε-nAChR內(nèi)向電流的抑制率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Sev和Iso各處理組中進(jìn)行組內(nèi)比較，ROC1組與ROC2、ROC3組的內(nèi)向電流抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。ROC2組與ROC3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。Sev和Iso兩處理組相同濃度水平的羅庫溴銨進(jìn)行組間比較，ROC1組的內(nèi)向電流抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。ROC2組和ROC3組的內(nèi)向電流抑制率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Compare inhibition rate of inward current of acetylcholine receptors between three different concentration of rocuronium after pretreatment of sevoflurane and isoflurane(±s)＊＊P＜0.01 vs Roc(IC5);△△P＜0.01 vs Roc(0.5 IC50);##P＜0.01 vs Sev+Roc;★★P ＜0.01 vs Iso+Roc

3 討論

揮發(fā)性吸入麻醉藥能增強(qiáng)NDMRs的肌松作用，其作用機(jī)制可能與揮發(fā)性吸入麻醉藥結(jié)合nAChR的位點(diǎn)促進(jìn)NDMRs與受體的結(jié)合有關(guān)。揮發(fā)性吸入麻醉藥與nAChR受體跨膜區(qū)中的M2區(qū)結(jié)合促進(jìn)NDMRs與nAChR的α-ε與α-δ亞基交界處的受體胞外部結(jié)合，增強(qiáng)抑制nAChR通道電流，阻滯通道開放［2］。本研究結(jié)果表明異氟醚、七氟醚存在條件下，非去極化肌松劑對結(jié)合位點(diǎn)親和力的變化導(dǎo)致離子通道功能改變的效應(yīng)［3］。臨床上進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)時，常預(yù)給小劑量的肌松劑后再給予插管所需劑量的肌松劑。該方法雖能明顯提高肌松劑的起效時間，但不能增強(qiáng)肌松效果，因而導(dǎo)致藥物的浪費(fèi)。揮發(fā)性吸入麻醉藥復(fù)合小劑量肌松劑用于麻醉誘導(dǎo)可能充分發(fā)揮肌松協(xié)同作用達(dá)到插管劑量的肌松效果。本研究證明羅庫溴銨在較低的濃度水平時，七氟醚、異氟醚均能發(fā)揮明顯的協(xié)同作用，異氟醚作用略強(qiáng)于七氟醚。隨著羅庫溴銨劑量的進(jìn)一步增加，七氟醚、異氟醚的協(xié)同能力相似且趨于緩和。該結(jié)果提示在麻醉誘導(dǎo)時預(yù)給小劑量肌松劑復(fù)合一定濃度的揮發(fā)性吸入麻醉藥能發(fā)揮單次大劑量肌松劑同等的肌松作用。本實驗中為了比較異氟醚和七氟醚對NDMRs增強(qiáng)效應(yīng)，使用揮發(fā)性麻醉藥的等效濃度使其具有相近的nAChR阻滯能力。根據(jù)文獻(xiàn)報道吸入麻醉藥等效抑制濃度與MAC換算關(guān)系［4］，濃度為 0.5 IC50的異氟醚相當(dāng)于 1.8MAC;濃度為0.5 IC50的七氟醚相當(dāng)于1.3 MAC。有臨床研究報道該MAC濃度的異氟醚和地氟醚對維庫溴銨的增強(qiáng)效應(yīng)相同［5］。這與本研究中異氟醚和七氟醚對高劑量的羅庫溴銨的協(xié)同作用結(jié)果相似。

本實驗運(yùn)用分子生物學(xué)基因重組和受體克隆技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)大鼠骨骼肌成人型乙酰膽堿受體的細(xì)胞模型。該方法已被國內(nèi)外廣泛用于研究肌肉和神經(jīng)型乙酰膽堿受體［6－7］。本實驗中僅涉及異氟醚、七氟醚對羅庫溴銨抑制ε-nAChR峰電流的影響，尚需進(jìn)一步研究對ε-nAChR通道開放的時效影響。

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