鐵包金總黃酮體內(nèi)對S180實體瘤的抑制作用

陳小龍，滕紅麗，沈玉霞，梅之南

鐵包金為鼠李科植物老鼠耳的根。藥材呈干燥根圓柱狀，粗細不一，商品多鋸成小段或切成厚片。栓皮結(jié)實，黑褐色或棕褐色，有網(wǎng)狀裂隙及縱皺。質(zhì)堅硬，斷面本部甚大，質(zhì)紋細致，暗黃棕色至橙黃色。產(chǎn)廣東、福建等地。具有化瘀血，祛風(fēng)濕，消腫毒。治肺癆久咳、喀血、吐血、跌打損傷、風(fēng)濕疼痛、癰腫、蕁麻疹等癥。臨床上用于治療小兒胃納呆滯、精神病、慢性氣管炎等。經(jīng)中南民族大學(xué)民族藥物研究所天然藥化分析，鐵包金的主要成分是黃酮類化合物，還包括蒽醌二聚體、木質(zhì)素等。近年來，對黃酮類化合物的研究表明:黃酮類化合物具有抗心血管疾病，抗炎及提高機體免疫力，雌激素樣等作用。我們對鐵包金的抗腫瘤作用進行了實驗研究，對鐵包金所含物質(zhì)進行了初步測定，使用S180小鼠模型進行了體內(nèi)抗腫瘤試驗?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 瘤株和動物 小鼠S180瘤株，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心);SPF級昆明種小鼠，武漢生物制品研究所，動物許可證號:SCXK(鄂)2008－0003。

1.2 藥品及試劑 實驗藥物鐵包金采于廣西，經(jīng)中南民族大學(xué)民族藥物研究所植物分類鑒定為鼠李科植物鐵包金(Berchemia lineata(L)DC［Rhamnus lineata L］)的根。鐵包金藥材粉碎，用8倍量體積分數(shù)為70%乙醇加熱回流提取3次，時間分別為1、1、0.5 h。提取液濃縮，抽濾后蒸干。甲醇溶出，石油醚萃取除酯，醇部位濃縮既得粗黃酮粉，備用。以兒茶素為標準品紫外定標曲線法檢測其總黃酮含量為63.2%。SOD、MDA試劑盒，南京建成公司;免疫組化試劑盒，武漢BOSTER公司。

2 方法

2.1 鐵包金總苷酮對S180實體瘤的抑制作用 無菌條件下取接種d 7生長良好的S180瘤源動物的腹水，立即至于滅菌后的錐形瓶中，以注射用生理鹽水按1∶3比例稀釋成瘤細胞懸液，并計數(shù)調(diào)整細胞濃度為每毫升2×106個活瘤細胞。取50只小鼠，♂♀各半，每只小鼠右前肢腋下皮下注射接種0.2 ml。接種后次日稱重，隨機分成5組，空白對照組(給予等體積蒸餾水)、陽性對照組(順鉑組濃度2.5 mg·kg－1，腹腔注射)、鐵包金總黃酮高、中、低劑量組(劑量分別為 480、240、120 mg·kg－1)，連續(xù)給藥 10 d。末次給藥24 h后稱重，脫臼處死動物，剪開腫瘤部位，完整剝離瘤塊，用濾紙吸凈其上液體，稱取瘤塊重量，計算抑瘤率。并且分離胸腺、脾臟和肝臟，精密稱重，計算胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)。

Tab 1Influence to S180 tumor-burdened mice tumor growth(±s，n=10)

Tab 1Influence to S180 tumor-burdened mice tumor growth(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d－1Weight/g Before After Tumor weight/g Inhibition rate/%Control － 21.63 ±0.92 23.62 ±1.69 1.43 ±0.21 －Cisplatin 2.25 20.14 ±0.85 15.61 ±1.32＊＊ 0.24 ±0.14＊＊ 83.22 High 480 20.62 ±0.99 23.24 ±1.71 0.71 ±0.21＊＊ 50.35 Middle 240 20.01 ±1.08 22.03 ±1.51 0.92 ±0.28＊＊ 35.66 Low 120 21.23 ±1.47 23.41 ±1.19 1.10 ±0.11＊＊23.08

Tab 2 Influence to index of thymus，spleen and liver ± s，n=10)

Tab 2 Influence to index of thymus，spleen and liver ± s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d －1 Index of thymus/mg·g－1 Index of spleen/mg·g－1 Index of liver/mg·g －1 Control － 3.61 ±1.01 14.02 ±1.20 61.95 ±6.56 Cisplatin 2.25 0.93 ±0.30＊＊ 4.07 ±0.47＊＊ 48.39 ±3.30＊＊High 480 3.99 ±0.88 12.25 ±1.18 54.58 ±6.31 Middle 240 3.61 ±0.72 13.09 ±1.97 61.36 ±6.23 Low 120 3.62 ±0.76 13.39 ±0.52 61.40 ±6.83

2.2 測量血液的SOD值和MDA值 處死前，摘除眼球取血，離心后保留血清備用。按照試劑盒說明書，預(yù)試驗后取 30 μl測 SOD 值，取 100 μl測MDA值。

2.3 HE染色和免疫組化 瘤塊稱重后，立即置于4%多聚甲醛中固定4 d，之后置于30%的蔗糖-TBS緩沖液中脫水至腫瘤沉底。修整后石蠟切片(厚5 μm)，常規(guī)HE染色觀察。結(jié)果判定:低倍鏡下(×40)觀察壞死面積，按壞死面積大小分級判斷為灶狀壞死(+)、小片狀壞死)、大片狀壞死)。冰凍切片(20 μm)，步驟按試劑盒說明，DAB顯色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。根據(jù)檢測的目標蛋白一抗分別p53單克隆抗體，TNF-α單克隆抗體，Caspase-3單克隆抗體，均以棕黃色的強弱程度為觀察指標。

3 結(jié)果

3.1 鐵包金總黃酮對S180實體瘤的抑制作用Tab 1表明，與空白對照組比較，鐵包金總黃酮的高、中、低劑量組和順鉑組皆有抑制S180肉瘤生長作用(P＜0.01);鐵包金總黃酮組隨給藥劑量的增大，抑瘤作用逐漸增強，且顯示出明顯的劑量依賴性，順鉑組的抑瘤效果優(yōu)于給藥組(P＜0.01)，但順鉑組對于小鼠體重增長有明顯的影響，與空白對照組相比差別有顯著性(P＜0.01)，說明順鉑在抑制腫瘤生長的同時對機體有明顯的毒副作用。而鐵包金總黃酮各給藥組的小鼠體重與空白組相比差別無顯著性(P＞0.05)。Tab 2表明，與空白對照組相比，順鉑組的小鼠胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)明顯降低，且差別有顯著性(P＜0.01);鐵包金總黃酮各給藥劑量組的小鼠胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)與順鉑組比較差別有顯著性(P＜0.01)，與空白組比較差別無顯著性(P＞0.05)。

3.2 鐵包金總黃酮對S180小鼠體內(nèi)SOD和MDA水平的影響 Tab 3表明，鐵包金總黃酮各組升高小鼠的SOD值，且降低其MDA值，具有一定的量效關(guān)系。陽性組降低小鼠的SOD值，且升高其MDA值。與空白組相比差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 3Influence to SOD and MDA in plasma(±s，n=10)

Tab 3Influence to SOD and MDA in plasma(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1·d －1 SOD/kU·L －1 MDA/μmol·L －1 Control － 44.59 ±1.20 9.14 ±0.63 Cisplatin 2.25 16.93 ±1.16＊＊ 10.63 ±1.03＊＊High 480 54.11 ±0.20＊＊ 7.41 ±0.18＊＊Middle 240 51.77 ±0.89* 7.93 ±0.35*Low 120 49.32 ±1.25* 8.11 ±1.10*

3.3 HE染色和免疫組化 低倍鏡(×40)觀察:高、中劑量組可見組織大片壞死。低劑量組和NS組壞死區(qū)域較小，細胞生長活躍。順鉑組則壞死區(qū)域較大，細胞處于凋亡狀態(tài)(Fig 1)。結(jié)果見Tab 4。

以細胞內(nèi)棕黃色強弱來判斷腫瘤細胞內(nèi)p53，TNF-α和Caspase-3蛋白表達量的變化。結(jié)果顯示高、中、低各組 p53蛋白表達依次升高，TNF-α和Caspase-3蛋白表達依次降低。見Fig 2。

Fig 1 HE Dyeing results(×40)A:High;B:Middle;C:Low;D:Control;E:Cisplatin

Fig 2 Immnohistochemical results(×200)A:High;B:Middle;C:Low;D:Control;E:Cisplatin

Tab 4 Pathological statistical results(n=10)

4 討論

鐵包金是中國傳統(tǒng)一味藥材，具有消腫解毒，止血鎮(zhèn)痛，祛風(fēng)除濕等功效。本文對其抗腫瘤效果進行了研究，其對小鼠荷瘤具有很好的抑制作用，并且對小鼠機體沒有傷害，沒有順鉑的毒副作用。近年來國內(nèi)外對自由基的研究發(fā)現(xiàn)，自由基產(chǎn)生過多或清除能力下降，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。各種理化致癌因子在體內(nèi)經(jīng)過代謝活化形成自由基形式，并與其它自由基一起富集于脂質(zhì)細胞膜周圍，引起脂質(zhì)過氧化，破壞細胞的DNA而產(chǎn)生癌變。同時，自由基作用于脂質(zhì)產(chǎn)生的過氧化物及其產(chǎn)物丙二醛等既能致癌，也能導(dǎo)致突變。由此，清除自由基成為一條有效的抗癌、抑癌手段。MDA(丙二醛)是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈式終止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物:脂質(zhì)過氧化物(LOOH)形成的環(huán)狀過氧化物可斷裂形成烯醛、丙二醛，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機體組織細胞的脂質(zhì)過氧化程度。脂質(zhì)過氧化越活躍，則生成的MDA越多。SOD是有效清除超氧化物陰離子自由基的一類重要的抗氧化酶，能阻止由O2－啟動的自由基鏈鎖反應(yīng)。SOD的活力反映了機體清除氧自由基的能力。本實驗主要測定了S180荷瘤小鼠血漿MDA和SOD含量，顯示鐵包金總黃酮能降低 S180荷瘤小鼠血漿 MDA，升高SOD含量。提示鐵包金總黃酮抗腫瘤機制可能與清除自由基有一定關(guān)系。p53是一種腫瘤抑制基因，p53基因可以阻滯細胞周期、促進細胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定、抑制腫瘤血管生成等作用。在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現(xiàn)該基因的突變。TNF-α具有一定的殺死癌細胞作用。很多的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最后都是由Caspase來導(dǎo)致最后的凋亡的，凋亡包括內(nèi)源性線粒體細胞色素釋放途徑和外源性死亡受體途徑，而Caspase-3是最終凋亡執(zhí)行分子，其表達量可以顯示細胞凋亡的狀態(tài)。經(jīng)免疫組化研究可知，鐵包金總黃酮能降低小鼠體內(nèi)p53、Caspase-3，提升TNF-α蛋白的表達來抑制腫瘤的生長。其具體機制有待進一步研究。

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