8-異戊烯基柑橘素促進體外骨髓基質(zhì)干細胞成骨性分化的研究

明磊國，陳克明，葛寶豐，馬慧萍，翟遠坤

8-異戊烯基柑橘素是存在于啤酒花中的一種黃酮類化合物，Milligan等［1-3］報道，該化合物具有植物雌激素樣作用，可以用作雌激素替代品。而雌激素已廣泛應用于抗骨質(zhì)疏松替代療法，療效已得到臨床和實驗研究證實。本文通過研究8-異戊烯基柑橘素對體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響，初步探討其是否具有促進骨形成活性及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 120 g左右Wistar♂大鼠12只(甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(甘)2004-0006-152;8-異戊烯基柑橘素(Enzo，385-025-M005，USA);DMEM-12培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(蘭州民海生物工程公司);噻唑蘭(MTT)、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、α-萘基磷酸鈉、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、磷酸化抗壞血酸(Sigma公司);骨鈣素ELLSA檢測試劑盒(ids，UK);鈣鹽沉積量檢測試劑盒(BioVision，USA);RNAiso Reagent、反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、Easy Dilution稀釋液均由大連TaKaRa公司提供;引物由大連TaKaRa公司設計合成。

1.2 大鼠骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng) 將大鼠用乙醚麻醉并用體積分數(shù)75%乙醇浸泡消毒，超凈工作臺中剝離出股骨和脛骨，剪去兩端骨骺并向骨髓腔內(nèi)注入DMEM/F12培養(yǎng)液(含肝素鈉500 kU·L-1)，完全沖出骨髓，吹散細胞得單細胞懸液;用150目的濾網(wǎng)過濾并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1.0×108mol·L-1，以每孔100 μl接種于 96 孔培養(yǎng)板、1.5 ml接種于6孔板或1 ml接種于12孔板(Nunc)，培養(yǎng)液中含體積分數(shù)為10%的胎牛血清。在37℃、5%CO2、濕度飽和條件下培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，用0.1 mol·L-1PBS洗滌兩遍并更換新培養(yǎng)液。以后每72 h更換培養(yǎng)液1次，待細胞融合率達到80%以上時，進行成骨性誘導。

1.3 8-異戊烯基柑橘素最佳濃度的篩選 原代細胞接種于96孔板中，待BMSCs長滿80%孔底時換成骨性誘導培養(yǎng)基(DMEM/F12、1×10-7mmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉和 50 mg·L-1抗壞血酸)，同時加入 1 ×10-7、1 ×10-6、1 ×10-3、1 ×10-4mol·L-1的 8-異戊烯基柑橘素，對照組只加入8-異戊烯基柑橘素的載體溶液(1 μl DMSO/ml培養(yǎng)液)，每組平行做8孔。每72 h后更換培養(yǎng)液1次，于誘導培養(yǎng)的d 8進行ALP活性比較。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的ALP試劑盒，96孔板中每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各25 μl，37℃水浴15 min，每孔加入顯色液75 μl，充分混勻后在酶標儀上測定490 nm處的吸光度(OD)值。

1.4 細胞增殖分析 P1代細胞以3×107cells·L-1接種于96孔板中，每孔100 μl。24 h后依次加入8-異戊烯基柑橘素，使終濃度分別為1×10-7、1×10-6、1 ×10-5mol·L-1濃度的 1 ml·L-1，對照組加入不含8-異戊烯基柑橘素的載體溶液(DMSO)1 ml·L-1，每組平行做8孔。48 h和72 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗 2次;換含有 0.5%MTT的無血清DMEM/F12，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，振蕩溶解10 min完全溶解后，酶標儀上測定570 nm處的吸光度(OD)值。

1.5 成骨性分化分析 將原代培養(yǎng)細胞分為兩組進行成骨性誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)含體積分數(shù)為10%FBS的 DMEM/F12、1 ×10-7mmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉和 50 mg·L-1抗壞血酸。一組加入不同濃度的8-異戊烯基柑橘素，作為實驗組，另一組僅加入等體積的8-異戊烯基柑橘素載體溶液(DMSO)作為對照。常規(guī)72 h更換培養(yǎng)液1次，進行如下指標分析。

1.5.1 不同時間點ALP活性測定 P0代細胞以5×108cells·L-1接種于 24 孔板，每孔加 0.5 ml，培養(yǎng)3 d待細胞鋪滿孔底后更換誘導培養(yǎng)基，實驗組培養(yǎng)液中8-異戊烯基柑橘素的濃度為1×10-6mol·L-1，與對照組同時培養(yǎng)的 d 4、8、12、16 分別進行ALP活性測定，24孔板中每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各0.2 ml，37℃水浴15 min，每孔加入顯色液0.6 ml，充分混勻后于紫外分光光度計上測定507 nm處的吸光度(OD)值。用酚標準作標準并將檢測值換算為每15 min每毫克蛋白反應所產(chǎn)生的酚。

1.5.2 ALP組織化學染色 成骨性誘導培養(yǎng)16 d后棄培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加10%的福爾馬林固定2 min，隨即進行ALP組織化學染色。具體方法為:將α-萘基磷酸鈉和固藍RR各25 mg溶于pH 8.9的巴比妥-鹽酸緩沖液25 ml中，搖勻后每孔1 ml加入12孔板各孔中，待出現(xiàn)陽性結果后，停止染色，照像記錄，Image-Pro Plus 6.0掃描計數(shù)并計算陽性克隆的面積。

1.5.3 骨鈣素分泌量測定 分別收集成骨性誘導后0～4 d、4～8 d、8～12 d、12～16 d細胞更換培養(yǎng)液時的舊培養(yǎng)液1 ml，-20℃保存;ELLSA法測定，標準曲線制備及樣品測定方法按說明書操作;于酶標儀上450 nm處測定OD值，并通過標準曲線計算樣品中骨鈣素含量。

1.5.4 鈣鹽沉積量測定 在皿中分別于成骨性誘導培養(yǎng)d 4、8、12、16進行鈣含量測定。具體方法:棄培養(yǎng)液，PBS洗兩次，加1 mol·L-1的HCl每皿2 ml，吹起貼壁細胞并超聲波破碎，在搖床上搖動過夜后1 000 r·min-1離心10 min并收集上清液;標準曲線制備及樣品的測定方法按說明書操作;與酶標儀上570 nm處測定OD值，并通過標準曲線計算每皿樣品中鈣鹽沉積量。

1.5.5 茜素紅組織化學染色 成骨性誘導培養(yǎng)d 16，進行茜素紅染色，具體方法如下:棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入pH 8.9、0.1%的茜素紅染色液，每皿3 ml，37℃水浴1 h，顯微鏡下觀察結果、照相并記錄，Image-Pro Plus 6.0掃描計數(shù)并計算陽性克隆的面積。

1.5.6 RT-Real Time PCR分析 成骨性誘導前12 h實驗組加入終濃度為1×10-6mol·L-1的8-異戊烯基柑橘素，對照組加入等體積的8-異戊烯基柑橘素載體溶液。分別在成骨性誘導培養(yǎng)0、6、12、24、48、72 h，提取總 RNA，檢測 bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2、BMP-2及COL-Ⅰ的mRNA表達水平。所用引物均委托寶生物(大連)公司根據(jù)Genbank所發(fā)布的序列設計并合成(Tab 1)，總RNA的提取采用TRIzol一步法進行，紫外分光光度計檢測濃度，并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測其完整性。調(diào)整總RNA 的濃度至50 mg·L-1，取 2 μl將其逆轉錄為cDNA。逆轉錄體系、PCR擴增體系及反應條件均參照說明書設定。以標本中所提取的高濃度、高純度RNA逆轉錄后得到的cDNA作為標準品，經(jīng)等比稀釋后，進行PCR反應制備標準曲線。經(jīng)內(nèi)參校正，求得目的基因的相對表達水平。

Tab 1 The primer sequence of RT-Real Time PCR

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)的細胞，BMSCs貼壁而血細胞及單核細胞不貼壁，兩天后BMSCs開始克隆，隨著更換培養(yǎng)液液次數(shù)的增加，不貼壁細胞逐漸被洗去;Fig 1A是BMSCs培養(yǎng)3 d首次更換培養(yǎng)液后形態(tài)，細胞以長梭形為主;Fig 1B是BMSCs培養(yǎng)6 d第2次更換培養(yǎng)液形態(tài)，細胞開始大量克隆;Fig 1C是BMSCs藥物干預并成骨誘導6 d后，細胞分化并融合，鋪滿皿底的形態(tài);Fig 1D是BMSCs藥物干預并成骨誘導12 d后，細胞成骨分化成熟并沉積骨基質(zhì)，形成鈣化結節(jié)。

Fig 1 A:BMSCs were cultured 3 days;B:BMSCs were cultured 6 days;C:BMSCs were cultured 6 days in inducing medium;D:BMSCs were cultured 12 days in inducing medium

2.2 不同濃度8-異戊烯基柑橘素對 BMSCs的ALP活性影響 實驗組與對照組之間采用方差分析法進行數(shù)據(jù)分析。ALP是成骨性分化的標志性酶，在490 nm的OD值越高，表明ALP活性越強，則成骨性分化愈強;由Tab 2可知，不同濃度梯度的8-異戊烯基柑橘素干預BMSCs后，結合細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)1×10-4mol·L-1對細胞有較大的損害，其余3組均有促進ALP活性的功能，其中1×10-6mol·L-1組明顯高于對照組、1×10-7mol·L-1和1×10-5mol·L-1組，差異有統(tǒng)計學意義。表明終濃度為1×10-6mol·L-1的8-異戊烯基柑橘素對BMSCs作用效果最明顯。

2.3 對BMSCs增殖的影響 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。如Tab 3所示，培養(yǎng)液中8-異戊烯基柑橘素濃度為1×10-5、1 ×10-6、1 × 10-7mol·L-1時，OD 值低于對照組，說明3種濃度均不促進細胞增殖。

Tab 2Effect of 8-Prenylnaringenin on ALP activity(±s，n=6)

Tab 2Effect of 8-Prenylnaringenin on ALP activity(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group OD490 Control 1.0833±0.2634 1×10-4mol·L-1 0.6479±0.1911 1×10-5mol·L-1 1.3873±0.2478*1×10-6mol·L-1 2.5281±0.1682＊＊1×10-7mol·L-1 1.4535±0.3594*

Tab 3 Effect of 8-Prenylnaringenin on BMSCs proliferation(±s，n=6)

Tab 3 Effect of 8-Prenylnaringenin on BMSCs proliferation(±s，n=6)

*P＜0.05 vs control

Group OD570 48 h 72 h Control 0.3806±0.0204 0.6175±0.0158 1×10-5mol·L-1 0.3038±0.0135* 0.5222±0.0231*1×10-6mol·L-1 0.3682±0.0152 0.5936±0.0213 1 ×10-7mol·L-10.3742±0.0135 0.6022±0.0182

2.4 對BMSCs成骨性分化的影響

2.4.1 對BMSCs的ALP活性影響 由Fig 2可見，成骨性誘導4 d開始8-異戊烯基柑橘素組在各時間點的ALP活性均高于對照組;d 8～12 ALP活性上升最快，在d 12～16 ALP增加幅度較小，說明8-異戊烯基柑橘素刺激ALP增加主要集中在d 8～12。d 12和d 16分別是對照組的1.72和1.68倍;各時間點與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。

Fig 2 Comparison of the ALP activity in BMSCs between experiment group and control(n=4)ALP activity in experiment group was stronger than that in control group，especially on 12th and 16th day. *P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

2.4.2 ALP組織化學染色結果 成骨性誘導d 16的ALP組化染色結果(Fig 5a)表明，8-異戊烯基柑橘素組ALP陽性克隆子數(shù)目及克隆子所占皿底的表面積明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Tab 4)。

Tab 4Effect of 8-Prenylnaringenin on cell CFU-ALP(±s，n=4)

Tab 4Effect of 8-Prenylnaringenin on cell CFU-ALP(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Number of CFU Total area of CFU(mm2/dish Control 164±3.68 41.5194±2.427 8-Prenylnaringenin 210±4.25* 80.5156±2.884)＊＊

2.4.3 對BMSCs分泌骨鈣素的影響 由Fig 3可知，BMSCs成骨性誘導后，8-異戊烯基柑橘素組骨鈣素含量均高于對照組，特別是d 4～8骨鈣素分泌最活躍，是對照組的2.14倍，說明BMSCs的成骨性分化最強烈，d 12～16有所下降，但仍高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義。

Fig 3 Comparison of the osteocalcin secretion in BMSCs between experiment group and control(n=4)Experiment group was stronger than control group at anytime，especially on 4～12 days.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

2.4.4 對BMSCs鈣鹽沉積量的影響 由Fig 4可知，誘導前4～6 d后開始礦化并沉積鈣鹽，隨時間增長鈣鹽含量逐漸上升，尤其是d 8～16沉積量明顯增強，d 16達到最高，d 12和d 16分別是對照組的2.82和2.21倍。8-異戊烯基柑橘素實驗組從d 8開始高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義。

2.4.5 對形成鈣化結節(jié)的影響 d 16的茜素紅組化染色結果表明，鈣化結節(jié)染色結果呈陽性(Fig 5b)，8-異戊烯基柑橘素實驗組的鈣化結節(jié)數(shù)目及其所占皿底的表面積高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Tab 5)。

2.4.6 對基因表達的影響 bFGF、IGF-1、OSX、Runx-2、BMP-2、COL-Ⅰ、GAPDH 的溶解曲線均只見一個特異性峰，表明引物的特異性好。各基因的擴增曲線都呈“S”型，說明擴增效率較高。每個樣本平行做3組(n=3)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用重復測量的方差分析法處理，各基因相對表達量分析結果如下:

Fig 4 Comparison of the calcium salt sediment yield in BMSCs between experiment group and control(n=4)Experiment group was stronger than control group at anytime，especially on 12th and 16th day.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Fig 5 Comparison of the CFU-ALP(Fig 5a)and CFU-Ca(Fig 5b)area in BMSCsThere was obviously more CFU-ALP and CFU-Ca in 8-Prenylnaringenin group than in control.C represented control group，E represented 8-Prenylnaringenin group

Tab 5 Effect of 8-Prenylnaringenin on cell CFU-Ca ± s，n=4)

Tab 5 Effect of 8-Prenylnaringenin on cell CFU-Ca ± s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Number of CFU Total area of CFU/mm2/dish Control 58±2.25 38.3894±2.168 8-Prenylnaringenin 122±3.55＊＊ 167.8951±3.747＊＊

2.4.6.1 bFGF 該基因表達在誘導后4 h達到最高值，此后表達量有下降趨勢，但在不同時間點實驗組表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Tab 6)。

2.4.6.2 IGF-Ⅰ 該基因表達隨著培養(yǎng)時間的增加而增大，48 h達到最大值;在測定的不同時間點，8異戊烯基柑橘素均明顯提高IGF-ⅠmRNA的水平，且在未誘導條件下也能促進該因子的表達，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(Tab 7)。

2.4.6.3 OSX 對照組OSX的表達在誘導4 h時達到較高值;實驗組在誘導后持續(xù)升高，到12 h達到最高值，隨時間的延長均有所下降。實驗組各時間點均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Tab 8)。

2.4.6.4 Runx-2 該基因表達量在誘導后0～12 h逐步上升，12 h達到最大值，之后開始下降，實驗組與對照組基因表達量的變化一致。實驗組在各時間點的表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Tab 9)。

2.4.6.5 BMP-2 該基因表達量在誘導后持續(xù)上升，0 h時的表達量實驗組與對照組之間無統(tǒng)計學意義，其余各時間點實驗組均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。說明8-異戊烯基柑橘素對BMSCs的BMP-2影響，主要在誘導條件下發(fā)揮作用(Tab 10)。

2.4.6.6 COL-Ⅰ 8-異戊烯基柑橘素干預后該基因表達量高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。表達量的變化趨勢與對照組一致，誘導后4 h達到峰值，誘導0 h時實驗組已明顯高于對照組，說明在不存在誘導劑的條件下，它也能夠上調(diào)COL-Ⅰ的表達，誘導條件下同樣發(fā)揮促進作用(Tab 11)。

Tab 6 Effect of 8-Prenylnaringenin on mRNA bFGF expression

Tab 7 Effect of 8-Prenylnaringenin on mRNA IGF-Ⅰexpression

Tab 8 Effect of 8-Prenylnaringenin on OSX mRNA expression

Tab 9 Effect of 8-Prenylnaringenin on Runx-2 mRNA expression

Tab 10 Effect of 8-Prenylnaringenin on BMP-2 mRNA expression

Tab 11 Effect of 8-Prenylnaringenin on COL-ⅠmRNA expression

3 討論

成骨細胞和破骨細胞的功能平衡是骨質(zhì)疏松發(fā)生的機制核心，在研究或篩選抗骨質(zhì)疏松藥物時也以對這兩種細胞的影響為主要依據(jù)或評價標準。然而隨著對BMSCs研究的深入，其在骨質(zhì)疏松發(fā)生中可能發(fā)揮的重要作用日益引起人們的高度重視。在骨發(fā)生和新骨形成過程中，BMSCs是成骨細胞的重要來源，在機體成骨活動中的作用極其重要，如果其分化成骨的機制發(fā)生障礙就會導致成骨細胞數(shù)量不足或功能降低，從而導致骨形成水平降低。同時會引起骨密度下降，骨量丟失，骨折率升高等骨質(zhì)疏松癥狀。相反，如果能夠誘導促進其向成骨細胞方向分化，則有望防治骨質(zhì)疏松。因此，當認識到BMSCs的重要作用以后，在研究發(fā)病機制或進行新藥研究時就必須考慮藥物對BMSCs的作用和影響［9］。

Christoffel等［4］的研究發(fā)現(xiàn)8-異戊烯基柑橘素能夠抑制骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度下降;Stephan等［5］比較研究了8-異戊烯基柑橘素、6-異戊烯基柑橘素和6，8-異戊烯基柑橘素的抗骨質(zhì)疏松活性，發(fā)現(xiàn)8-異戊烯基柑橘素的活性最強;本實驗以BMSCs作為研究對象，首先以ALP為篩選指標篩選確定了8-異戊烯基柑橘素的有效濃度范圍，同時對細胞的增殖作用做了研究，發(fā)現(xiàn)其無促進細胞增殖作用。通過比較分析成骨性分化的多項指標發(fā)現(xiàn)，1×10-6mol·L-1的8-異戊烯基柑橘素能強烈促進 BMSCs的成骨性分化，表現(xiàn)為可誘導提高成骨細胞標志酶ALP的活性并增加ALP陽性克隆數(shù)、提高骨鈣素分泌量、增加鈣鹽沉積量和鈣化結節(jié)數(shù)。除此之外，8-異戊烯基柑橘素也明顯提高了成骨相關因子bFGF、IGF-1、BMP-2和成骨相關轉錄因子Osterix和Runx-2，以及骨基質(zhì)蛋白COL-Ⅰ的基因表達量，差異有統(tǒng)計學意義。實驗結果表明，8-異戊烯基柑橘素具有促進BMSCs成骨性分化的活性，可能是其抗骨質(zhì)疏松的重要機制。同時在試驗中觀察到，在不進行BMSCs成骨性誘導，只用8-異戊柑橘素干預BMSCs時，8-異戊柑橘素有抑制BMSCs成脂肪細胞分化促進成骨性分化的作用，但具體的量化指標及基因調(diào)控過程需要進一步實驗論證。

在前期研究中陳克明［6-8］和筆者［9-11］等研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷和蛇床子素對骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞的分化成熟有明顯促進作用，值得注意的是淫羊藿苷和蛇床子素的8位碳上也帶有異戊烯基，說明此基團與上述化合物的抗骨質(zhì)疏松活性密切相關，此基團的準確定位將是下一步研究重點。本實驗說明了8-異戊烯基柑橘素對BMSCs具有促進成骨性分化作用，但其對其它成骨性相關細胞的影響、作用機制及分子結構與功能相關性等尚待進一步研究。

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