熱殺死結(jié)核分支桿菌H37Ra誘導(dǎo)的SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型研究

陳佩虹，陳育堯，林曉春，蘇健淦，佟 麗

在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型(adjuvant-induced arthritis，AA)是常用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，我們以熱殺死結(jié)核分支桿菌 H37Ra(Mycobacterium tuberculosis H37Ra，Mtb)成功誘導(dǎo)SD大鼠AA模型，該模型操作簡單、臨床癥狀直觀，其機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及關(guān)節(jié)病理改變等與人類RA臨床癥狀相似［1］。本項(xiàng)研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上，對Mtb誘導(dǎo)SD大鼠AA模型的血液學(xué)、關(guān)節(jié)滑膜病理、T細(xì)胞功能的改變進(jìn)行分析，以綜合評價(jià)該模型與臨床RA類疾病的相似性。

1 材料

1.1 動(dòng)物及分組 SPF級SD大鼠24只，♂，6～8周齡，體質(zhì)量(280±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(粵)2006-0015。動(dòng)物飼養(yǎng)條件:清潔通風(fēng)環(huán)境，室溫(23±1)℃，濕度(50±5)%，光照周期為12 h，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為兩組，正常對照組12只，AA模型組12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 熱殺死結(jié)核桿菌H37Ra，來自Difco實(shí)驗(yàn)室(Detroit，MI，USA);礦物油，美國 Sigma公司產(chǎn)品;紅細(xì)胞裂解液，Andybio公司產(chǎn)品，批號(hào) 090618;Pecy7-CD4、FITCCD25、PE-FOXP3 Rat Antibody及同型對照 Mouse IgG1、FOXP3 Fix/Perm Buffer、Cell Staining，均為 Biolegend 公司產(chǎn)品，批 號(hào) 分 別 為 B123582、B116371、B119654、B126005、B125798;大鼠淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)蠊井a(chǎn)品，批號(hào)20090304;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(內(nèi)含Annexin VFITC、Propidium Iodide 即 PI、Binding Buffer)及 TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒(內(nèi)含 Equilibration Buffer、Biotin-11-dUTP、TdT Enzyme、50 ×Proteinase K、Streptavidin-HRP、DAB)，均為南京凱基公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為090725、091125;其它化學(xué)試劑購自廣州試劑公司，均為AR級;Hanks液、PBS液自備。

1.3 器材 TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭公司;LG-R-80血液流變儀，北京世帝公司;BH2熒光顯微鏡，日本OLYMPUS公司;精密天平，德國Sartorius公司;RM2135切片機(jī)、EG1160包埋機(jī)、圖像采集系統(tǒng)，德國Leica公司;950動(dòng)物血球分析儀，美國DREW公司;520爪腫測試儀，美國IITC公司;FACS Calibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠模型制備［1］

2.1.1 Mtb誘導(dǎo)劑配制 準(zhǔn)確稱取Mtb，放入高壓消毒的研缽中，在無菌條件下，充分研磨，使Mtb的顏色由灰色變?yōu)榘咨?，然后加入少量礦物油，使Mtb與礦物油充分混合，再研磨，最后加入礦物油使Mtb質(zhì)量濃度為5 g·L-1，將該混懸液吸入特制玻璃注射器中，連接兩個(gè)注射器于三通管上，使Mtb-礦物油混懸液充分混合均勻，備用。

2.1.2 AA模型制作 將模型組動(dòng)物固定在大鼠固定器上，剃掉尾根部的毛發(fā)，以體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒，然后在尾根部經(jīng)皮下注射Mtb誘導(dǎo)劑(1 mg/只)，注射后，立即用消毒棉球壓住注射部位，防止液體滲出。對照組大鼠不做任何處理。

2.2 大鼠血常規(guī)、全血及血漿粘度測定 SD大鼠免疫后28 d，用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，取抗凝血，檢測外周血白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞總數(shù)(LY)、單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)(MO)、紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(Hb)、血小板總數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、全血粘度(BV)、血漿粘度(PV)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(RE)等。

2.3 大鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) SD大鼠免疫后16、28 d，用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血;取抗凝血與Hanks液1∶1混合，加入到大鼠淋巴細(xì)胞分離液面上，離心，分離單個(gè)核細(xì)胞;用Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入 5 μl Annexin V-FITC 混勻后，加入 5 μl PI，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min;在1 h內(nèi)，流式細(xì)胞術(shù)檢測AA大鼠模型外周血淋巴細(xì)胞凋亡率。

2.4 大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞測定 SD大鼠免疫后28 d，用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血;取抗凝血 100 μl，加入 20 μl Pecy7-CD4、FITC-CD25 Rat Antibody，對照管加同型對照抗體，室溫避光20 min;加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，室溫下10 min后離心吸棄上清;Cell Staining懸浮細(xì)胞，離心吸棄上清;加入1 ml FOXP3 Fix Buffer，室溫避光20 min后離心吸棄上清;FOXP3 Fix Perm Buffer洗兩遍并用100 μl該液懸浮細(xì)胞，加入 20 μl PE-FOXP3 Rat Antibody，對照管加同型對照抗體，室溫避光30 min;用Cell Staining洗1遍并懸浮細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)檢測AA大鼠模型外周血CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例、CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

2.5 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) SD大鼠免疫后16、28 d，用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，處死大鼠后取雙后膝關(guān)節(jié)滑膜，常規(guī)制作石蠟包埋的組織切片并進(jìn)行脫蠟、水合;PBS漂洗兩遍，加入Proteinase K工作液，21℃ ～37℃反應(yīng)20 min;PBS漂洗兩遍，浸入封閉液中10 min;PBS漂洗兩遍，樣本周圍用吸水紙吸干，每個(gè)樣本滴加50 μl TdT Enzyme反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)60 min;PBS漂洗3遍，樣本周圍用吸水紙吸干，每個(gè)樣本滴加50 μl Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)30 min;PBS漂洗3遍，樣本周圍用吸水紙吸干，每個(gè)樣本滴加100 μl DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)10 min;PBS漂洗3遍，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察滑膜細(xì)胞陽性表達(dá)情況，陽性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)為細(xì)胞質(zhì)著色，呈棕黃色或棕褐色。用圖像采集系統(tǒng)拍攝，每張切片任選5個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量陽性表達(dá)面積(Area)和累積光密度值(integrated optical density，IOD)，平均光密度值MIOD=IOD·Area-1。

2.6 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理研究 SD大鼠免疫后16、28 d，用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，處死大鼠后取雙后膝關(guān)節(jié)滑膜，固定24 h，石蠟包埋，將組織進(jìn)行5 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，100倍光學(xué)顯微鏡下觀察AA模型膝關(guān)節(jié)滑膜病理變化:滑膜細(xì)胞有無增生、變性，滑膜有無炎性細(xì)胞浸潤及肉芽組織形成。

3 結(jié)果

3.1 AA模型大鼠外周血常規(guī)及血液黏度的變化 Tab 1可見，SD大鼠免疫后28 d，WBC、MO上升，LY下降，但與正常組大鼠比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Hb下降，PLT、HCT上升，與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Tab 2可見，SD大鼠免疫后28 d，BV、PV上升，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);RE與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示SD大鼠在Mtb免疫后期，血液黏度明顯上升。

3.2 AA模型大鼠T淋巴細(xì)胞凋亡的變化 Tab 3、Fig 1可見(流式圖各象限含義:右上區(qū)PI+Annexing V+，為晚期凋亡細(xì)胞;左下區(qū)PI-Annexin V-，為正常細(xì)胞;右下區(qū)PI-AnnexinV+，為早期凋亡細(xì)胞)，SD大鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡率在免疫后16 d呈倍數(shù)升高，免疫后28 d明顯下降。表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)AA大鼠模型外周血淋巴細(xì)胞凋亡變化范圍較大，且在后期呈現(xiàn)凋亡缺陷，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.286，P ＜0.01)。

Fig 1 The change of PBL apoptosis ratio after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats A1，A2:the control group on the 16 th and 28 th day;B1，B2:the model group on the 16 th and 28 th day

Tab 1 The change of blood routine after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats±s，n=6)

Tab 1 The change of blood routine after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats±s，n=6)

*P＜0.05 vs control group

Index Group Control Model F P WBC/×109·L-118.19±4.53 24.25±5.32 4.515 0.060 LY/×109·L-1 4.64±1.64 4.06±0.96 0.567 0.469 MO/×109·L-1 1.09±0.35 1.56±0.50 3.615 0.086 RBC/×1012·L-1 8.52±0.17 8.12±0.46 3.922 0.092 Hb/g·dl-1 16.58±0.33 15.55±1.00* 5.758 0.037 PLT/×109·L-1 962.17±310.13 1350.17±131.16* 7.966 0.018 HCT/% 42.95±3.01 49.08±0.95*22.669 0.001

Tab 2 The change of blood rheology after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats(±s，n=6)

Tab 2 The change of blood rheology after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats(±s，n=6)

*P＜0.05 vs control group

Index Group Control Model F P BV150/s(mPas)6.94±0.41 7.29±0.56*9.020 0.013 PV100/s(mPas)1.62±0.04 2.93±0.65* 24.132 0.004 RE 2.46±0.03 2.40±0.21 0.402 0.553

Tab 3 The change of peripheral blood lymphocyte(PBL)apoptosis ratio after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats± s，n=3)

Tab 3 The change of peripheral blood lymphocyte(PBL)apoptosis ratio after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats± s，n=3)

Time effect:F=209.388，P ＜0.01;group effect:F=48.286，P ＜0.01;time·group effect:F=197.026，P＜0.01.＊＊P＜0.01 vs control group

Group PBL apoptosis ratio/%d 16 d 28 Control 13.85±0.92 13.42±1.81 Model 34.49±2.61＊＊ 6.46±0.83＊＊

3.3 AA模型大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化 Tab 4，F(xiàn)ig 2可見(流式圖右上區(qū)為所檢測的CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞及CD4+CD25+T細(xì)胞比例)，SD大鼠免疫后28 d，外周血CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例、CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=44.966，P=0.003及F=45.521，P=0.003)。表明在SD大鼠免疫后期，外周的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例水平低下。

Fig 2 The change of regulatory T cells after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats A1/A2:the control group;B1/B2:the model group

Tab 4 The change of regulatory T cells after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats±s，n=3)

Tab 4 The change of regulatory T cells after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group CD4+CD25+FOXP3+/CD4+(%)CD4+CD25+T cells/CD4+T cells(%)Control 3.71±0.80 5.34±0.64 Model 0.54±0.20＊＊ 2.59±0.34＊＊F 44.933 45.521 P 0.003 0.003

3.4 AA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡的變化 Tab 5、Fig 3可見，SD大鼠免疫后16、28 d，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡減少，與正常組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=233.398，P＜0.01)。表明在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)AA大鼠模型關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡缺陷。

Fig 3 The change of synoviocyte apoptosis after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats(n=3)*P＜0.05 vs control group

Tab 5 The change of synoviocyte apoptosis after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats±s，n=3)

Tab 5 The change of synoviocyte apoptosis after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats±s，n=3)

Time effect:F=2.914，P=0.126;group effect:F=233.398，P ＜0.01;time·group effect:F=2.554，P=0.149.＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Synoviocyte apoptosis-MIOD(×10-2·μm-2)d 16 d 28 Control 42.07±2.35 41.93±2.04 Model 24.09±2.65＊＊ 19.75±2.00＊＊

3.5 AA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理改變 Fig 4 A～D病理切片鏡下觀察可見:正常組(A)關(guān)節(jié)滑膜組織平滑光亮，薄而柔潤，分布于關(guān)節(jié)軟骨的周緣，分為滑膜襯里層及滑膜襯里下層;滑膜襯里層有1～4層滑膜細(xì)胞，細(xì)胞排列整齊，表面光滑，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組(B、C、D)關(guān)節(jié)滑膜組織大多數(shù)出現(xiàn)典型的病理改變，滑膜有6～10層甚至20層滑膜細(xì)胞，呈輕度到中度變性、中度到極重度異常增生不等，呈短絨毛狀或指突狀;滑膜有大量炎性細(xì)胞浸潤，并有肉芽組織形成。

Fig 4 The pathological evidence after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats(×100，HE stain)A～D pathological evidence after Mtb-immunized adjuvant arthritis in SD rats.A:the control group;B and C:the model group on 16 th day，D:the the model group on 28 th day，synovial membrane hyperplasia serious and inflammatory cells infiltrated.

4 討論

4.1 Mtb誘導(dǎo)的SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的特點(diǎn) 本課題組先前研究結(jié)果表明［1］用Mtb誘導(dǎo)SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的病情表現(xiàn)及進(jìn)程與臨床RA相近，同時(shí)該模型制作方法簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，成模率高，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

在本項(xiàng)研究中采用相同的模型制作方法，Mtb用量是1 mg/只大鼠，模型成功率為100%，但是模型組炎癥出現(xiàn)時(shí)間推遲到免疫后第10～13天，炎癥高峰出現(xiàn)在免疫后第19～25天，可能是由于本項(xiàng)研究所用SD大鼠的體質(zhì)量(280 g)超過先前研究時(shí)所用大鼠體質(zhì)量(160 g)所致，建議今后根據(jù)所用大鼠的體質(zhì)量確定Mtb誘導(dǎo)劑的用量。Mtb免疫后期，模型組大鼠出現(xiàn)的癥狀與之前研究類似，但是限于實(shí)驗(yàn)周期，沒有根據(jù)炎癥出現(xiàn)時(shí)間推遲而延長觀察時(shí)間，是本項(xiàng)研究的不足之處。

臨床研究表明RA患者大部分存在血液常規(guī)異常，貧血占第一位，其次是白細(xì)胞減少和血小板增高［2］。血液流變方面，RA患者全血黏度、血漿黏度、纖維蛋白原、免疫球蛋白、血沉均升高，紅細(xì)胞壓積與正常比較差異無顯著性［3-4］。本項(xiàng)研究的血液學(xué)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道有一致之處，但是由于本項(xiàng)研究僅采取了一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血液學(xué)標(biāo)本，因此只能代表該模型在后期血液學(xué)改變，尚不能清楚了解該模型整個(gè)病程血液學(xué)改變的全貌，有必要在今后研究中進(jìn)一步觀察。

RA是典型的自身免疫性疾病，滑膜細(xì)胞和淋巴細(xì)胞過度活化、凋亡異常以及滑膜過度增殖是RA發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。本結(jié)果表明，AA模型大鼠在病程中期外周血淋巴細(xì)胞凋亡率急劇升高，后期則比正常水平下降。原因可能是在病理中期外周血淋巴細(xì)胞急劇活化、增殖的同時(shí)，細(xì)胞代償性凋亡的速度加快;而淋巴細(xì)胞代償性凋亡后至病理后期，細(xì)胞凋亡率下降到較低水平出現(xiàn)凋亡障礙。在整個(gè)病程中由于淋巴細(xì)胞異常活化及凋亡機(jī)制障礙，誘導(dǎo)大量炎癥因子產(chǎn)生，并通過介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，引起組織損傷酶的釋放，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，引發(fā)并促進(jìn)RA的發(fā)生發(fā)展。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是具有抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，約占人和小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的0.02～0.10［5］，這類細(xì)胞在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3被認(rèn)為是CD4+CD25+Treg的特異性標(biāo)志。在近年的臨床研究中，越來越多的證據(jù)表明RA患者CD4+CD25+Treg存在異常，但目前國內(nèi)外對RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞的研究結(jié)果不一致［6］。采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色檢測細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的FOXP3分子，在單細(xì)胞水平分析FOXP3分子表達(dá)，是一種快速、簡便的方法。本項(xiàng)研究所采集的標(biāo)本代表未受藥物影響的RA病理后期Treg水平。本結(jié)果表明，AA模型大鼠外周血CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例及CD4+CD25+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例均低于正常組。原因可能是:①因?yàn)镽A發(fā)生，大鼠胸腺功能缺陷導(dǎo)致天然Treg的產(chǎn)生受損;②Treg具有調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的功能，Treg向受累的關(guān)節(jié)內(nèi)遷移(集聚在關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)以利于控制局部炎癥)，導(dǎo)致外周血表達(dá)水平降低。

RA最突出的免疫病理基礎(chǔ)發(fā)生在關(guān)節(jié)滑膜，病理特征之一為滑膜浸潤大量炎性細(xì)胞，滑膜細(xì)胞增生及血管翳形成，其機(jī)制仍未闡明。目前醫(yī)學(xué)界認(rèn)為RA的發(fā)病與細(xì)胞凋亡過程異常有關(guān)，并有多種細(xì)胞參與，包括滑膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。本結(jié)果表明AA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞在病理中期及后期的凋亡率均比正常水平降低，表明滑膜細(xì)胞存在凋亡缺陷;AA大鼠病理結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)滑膜周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜增生、變性。

4.2 RA動(dòng)物模型制備方法的篩選 有研究者提出理想的RA動(dòng)物模型具備的條件是:①在病原學(xué)和發(fā)病機(jī)制方面與人類相似;②臨床表現(xiàn)與組織學(xué)改變與人類相似;③模型容易獲得，施加相同的實(shí)驗(yàn)條件所獲得的結(jié)果相同;④模型建立后，效果穩(wěn)定，并且可以長期維持［7］。

本結(jié)果結(jié)合課題組已有的相關(guān)研究成果如模型大鼠的癥狀、細(xì)胞因子水平、T淋巴細(xì)胞亞群CD3/CD4/CD8水平、后肢X-射線檢測等，綜合評價(jià)Mtb誘導(dǎo)的AA大鼠模型:該模型材料容易獲得，SD大鼠有較高敏感性，制作方法簡單;模型建立后維持時(shí)間較長;發(fā)病原理主要是分子模擬理論，結(jié)核桿菌的一個(gè)蛋白分子與關(guān)節(jié)滑膜上的一個(gè)糖蛋白分子結(jié)構(gòu)相似，可以被同一株T細(xì)胞克隆所識(shí)別，從而誘發(fā)針對關(guān)節(jié)的免疫反應(yīng);臨床表現(xiàn)與組織學(xué)改變與人RA相似。目前研究結(jié)果提示此模型存在明顯的細(xì)胞免疫異常，而RA患者多同時(shí)表現(xiàn)有體液和細(xì)胞免疫功能的異常，關(guān)于該模型體液免疫功能是否異常有待后續(xù)深入研究。

［1］佟 麗，辛增輝，陳育堯，等.Mtb誘導(dǎo)的SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的建立及評價(jià)［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(2):259-63.

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