機(jī)械牽張誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞高遷移率族蛋白B1移位出核*

丁 寧， 肖 慧， 許立新， 佘守章

(廣州市第一人民醫(yī)院1麻醉科和麻醉學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2門診部，廣東 廣州 510180)

機(jī)械牽張誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞高遷移率族蛋白B1移位出核*

丁 寧1△， 肖 慧2， 許立新1， 佘守章1

(廣州市第一人民醫(yī)院1麻醉科和麻醉學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2門診部，廣東 廣州 510180)

目的探討機(jī)械牽張對(duì)高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1細(xì)胞內(nèi)移位的影響。方法構(gòu)建HMGB1-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表達(dá)載體。通過兩步亞克隆的方法，將HMGB1和EGFP的編碼序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA載體上，隨后轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞并施加機(jī)械牽張應(yīng)變，熒光顯微鏡觀察HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及移位情況。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定證明構(gòu)建正確，并在THP-1細(xì)胞中大量表達(dá)。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于細(xì)胞核，經(jīng)機(jī)械牽張18 h，可見細(xì)胞中融合蛋白從細(xì)胞核移位到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞漿中觀察到明顯的綠色熒光。結(jié)論成功構(gòu)建了HMGB1-EGFP融合蛋白，在THP-1細(xì)胞中觀察到機(jī)械牽張可誘導(dǎo)HMGB1移位出核。

機(jī)械牽張； 高遷移率族蛋白質(zhì)類； THP-1細(xì)胞

呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)是危重病人進(jìn)行機(jī)械通氣支持治療時(shí)常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，其本質(zhì)是由機(jī)械牽張所引起的肺內(nèi)炎癥介質(zhì)過度釋放，引起或加重肺損傷[1-3]。我們研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein, HMGB1)作為關(guān)鍵性“晚期”炎癥介質(zhì)，在VILI的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[4,5]，并利用熒光素酶報(bào)告基因載體系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張對(duì)HMGB1蛋白的激活作用發(fā)生于轉(zhuǎn)錄水平[6]。為了進(jìn)一步證實(shí)HMGB1在VILI中的作用及其在細(xì)胞內(nèi)的定位與移位機(jī)制，我們構(gòu)建了HMGB1的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)融合表達(dá)載體，通過綠色熒光蛋白示蹤技術(shù)，觀察其在機(jī)械牽張誘導(dǎo)下的細(xì)胞內(nèi)定位和移位情況。

材 料 和 方 法

1材料

質(zhì)粒pEGFP-C2購(gòu)自Clontech， pcDNA3-HA、pET14b-EGFP和THP-1細(xì)胞系由本室保存，pGEX-4T-HMGB1由日本Kimitoshi Kohno博士惠贈(zèng)。PolyFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Qiagen，DAPI染色試劑購(gòu)自Molecular Probes，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco-BRL，胎牛血清fetal bovine serum，F(xiàn)BS購(gòu)自HyClone，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自U-gene，限制性核酸內(nèi)切酶KpnI、EcoR I、XhoI、BamH I、T4 DNA連接酶、高保真DNA聚合酶KOD plus和堿性磷酸酶購(gòu)自ToYoBo，引物由北京賽百盛公司合成。

2方法

2.1HMGB1-EGFP真核表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)分別含KpnI酶切位點(diǎn)的上、下游引物，上游引物為5'-cat ggt acc ggc aaa gga gat cct aag aag c-3'， 下游引物為5'- cat ggt acc ttc atc atc atc atc ttc ttc ttc at-3'，從pGEX-4T-HMGB1質(zhì)粒上擴(kuò)增HMGB1編碼序列，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 15 s，53 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。對(duì)質(zhì)粒pET14b-EGFP行KpnI酶切并回收產(chǎn)物。二者以T4 DNA連接酶在16 ℃過夜連接，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌并接種于LB瓊脂培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)12 h。挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基37 ℃振搖過夜，提取質(zhì)粒后行PCR、BamH I酶切和測(cè)序鑒定，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pET14b-HMGB1-EGFP。

分別設(shè)計(jì)含EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的上、下游引物，上游引物為5'-cat ggt acc ggc aaa gga gat cct aag aag c-3'，下游引物為5'-cat ggt acc ttc atc atc atc atc ttc ttc ttc at-3'，從載體pET14b-HMGB1-EGFP上擴(kuò)增融合的HMGB1-EGFP編碼序列。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 15 s，53 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)。用EcoR I和XhoI分別對(duì)PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3-HA進(jìn)行雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌并接種于LB瓊脂培養(yǎng)板,37 ℃、5 % CO2孵箱培養(yǎng)12 h。挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基37 ℃振搖過夜。提取質(zhì)粒后行PCR、EcoR I和XhoI酶切及測(cè)序鑒定，構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA3-HMGB1-EGFP。

2.2脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10 % FBS、0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM中，置于37 ℃、5 % CO2孵箱傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞鋪于Bioflex板，待細(xì)胞至約70 %融合時(shí)，加入0.4 μg質(zhì)粒DNA和3 μg PolyFect轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫孵育10 min。在DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物中加入含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5 % CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3實(shí)驗(yàn)分組及機(jī)械牽張 實(shí)驗(yàn)分組：(1) pEGFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組；(2) pcDNA3-HMGB1-EGFP轉(zhuǎn)染組；(3) pcDNA3-HMGB1-EGFP轉(zhuǎn)染+機(jī)械牽張組，應(yīng)用Flexercell 4000T應(yīng)變加載系統(tǒng)給予THP-1細(xì)胞加載牽張應(yīng)變，應(yīng)變幅度設(shè)為20%，牽張頻率設(shè)為30次/min，機(jī)械牽張組在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h于含有10 % FBS的新鮮DMEM按不同刺激時(shí)間(1 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h和48 h)繼續(xù)培養(yǎng)，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4熒光顯微鏡觀察 細(xì)胞以PBS洗滌后，用4 %多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌3次后用0.1%硼氫化鈉處理5 min，PBS再次洗滌3次，以100 μg/L的DAPI染核5 min，PBS洗滌、封片后分別利用熒光顯微鏡(Leica)的A4和L5濾光片進(jìn)行觀察并拍照。

結(jié) 果

1質(zhì)粒pET14b-HMGB1-EGFP的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳可見約650 bp的片段，與插入的DNA大小相符。BamH I單酶切產(chǎn)物電泳可見約5 kb和1.2 kb 2個(gè)條帶，表明單點(diǎn)插入方向正確。測(cè)序結(jié)果也表明質(zhì)粒構(gòu)建正確，見圖1。

Figure 1. Identification of recombinant vector pET14-HMGB1-EGFP. M: 1 kb DNA marker; 1: PCR product; 2: pET14-HMGB1-EGFP digested by BamH I.

2質(zhì)粒pcDNA3-HMGB1-EGFP的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳可見約1.4 kb的片段，與插入的DNA序列大小相符。EcoR I和XhoI雙酶切鑒定產(chǎn)物電泳可見5.4 kb和1.4 kb 2個(gè)條帶，其中1條與pcDNA3-HA原質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果一致，另1條與PCR產(chǎn)物大小一致，見圖2。

Figure 2. Identification of recombinant vector pcDNA3-HMGB1-EGFP. M: 1 kb DNA marker; 1: PCR product; 2: pcDNA3-HMGB1-EGFP digested by EcoR I and Xho I; 3: pcDNA3-HA digested by EcoR I and Xho I.

3機(jī)械牽張對(duì)HMGB1-EGFP融合蛋白在細(xì)胞中定位的影響

單純轉(zhuǎn)染pEGFP后綠色熒光均勻分布于整個(gè)細(xì)胞(圖3A-D)；HMGB1-EGFP轉(zhuǎn)染則見到綠色熒光定位于細(xì)胞核(圖3E-H)；HMGB1-EGFP轉(zhuǎn)染18 h后，綠色熒光仍然主要定位于細(xì)胞核(圖3M-P)，而HMGB1-EGFP轉(zhuǎn)染并施加機(jī)械牽張18 h后，細(xì)胞核內(nèi)熒光蛋白明顯向細(xì)胞質(zhì)移位(圖3I-L)，而在1 h-12 h內(nèi)未見移位現(xiàn)象。

Figure 3. Expression and localization of HMGB1-EGFP fusion protein in THP-1 cells. A-D: THP-1 cells transfected with pEGFP; E-H: THP-1 cells transfected with HMGB1-EGFP and cultured for 6 h; I-L: THP-1 cells transfected with HMGB1-EGFP and subject to mechanical stretch for 18 h; M-P: THP-1 cells transfected with HMGB1-EGFP and cultured for 18 h; A, E, I, G: bright-field images; B, F, J, N: EGFP-immunofluorescent images; C, G, K, O: nuclei labeled with DAPI; D, H, L, P: merge of EGFP and DAPI. Bar: 20 μm.

討 論

HMGB1是HMG蛋白超家族成員之一，因其分子量小、聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)快速遷移而得名[7]。HMGB1在細(xì)胞內(nèi)外均有分布：在細(xì)胞核內(nèi)，它與DNA結(jié)合，發(fā)揮維持核小體穩(wěn)定、調(diào)控基因復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等重要作用；分泌到胞質(zhì)或胞外則具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、產(chǎn)生趨化作用、作為重要的炎癥因子參與機(jī)體炎癥反應(yīng)等重要作用[8,9]。HMGB1分泌到細(xì)胞外的途徑有2種：細(xì)胞壞死后被動(dòng)釋放和在外界刺激因素的作用下主動(dòng)分泌。既往研究表明，HMGB1在脂多糖的作用下，可以由細(xì)胞核分泌到胞外，作為"晚期"炎癥介質(zhì)參與膿毒癥的發(fā)病過程[10]。

機(jī)械通氣產(chǎn)生的牽張應(yīng)變可誘導(dǎo)肺內(nèi)炎癥介質(zhì)大量表達(dá)和釋放，進(jìn)而引起或加重肺損傷。最近一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大潮氣量通氣(VT=30 mL/kg)組家兔支氣管肺泡灌洗液中HMGB1水平是小潮氣量通氣(VT=8 mL/kg)組的5倍，而給予抗HMGB1抗體預(yù)處理則明顯減輕大潮氣量通氣引起的肺微血管通透性增加，并顯著減少TNF-α的產(chǎn)生[11]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽張可以顯著增加HMGB1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)[3,4,12]。

為了進(jìn)一步探索HMGB1在VILI中的作用及其機(jī)制，本研究構(gòu)建了HMGB1-EGFP融合表達(dá)載體，在細(xì)胞中表達(dá)帶熒光標(biāo)記的HMGB1，通過熒光顯微鏡檢測(cè)機(jī)械牽張時(shí)HMGB1蛋白的功能和行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未施加機(jī)械牽張時(shí)HMGB1蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。機(jī)械牽張細(xì)胞18 h后，細(xì)胞質(zhì)中也觀察到綠色熒光，而未牽張組沒有變化，說明細(xì)胞核中的綠色熒光蛋白在受到機(jī)械牽張后向胞漿移位。在機(jī)械牽張的12 h內(nèi)未觀察到移位現(xiàn)象，而機(jī)械牽張36 h后仍然在細(xì)胞質(zhì)中觀察到明顯的綠色熒光，說明HMGB1蛋白的移位反應(yīng)在時(shí)間上是延遲的，直觀地證實(shí)了HMGB1作為“晚期”炎癥介質(zhì)參與VILI的發(fā)生發(fā)展。

Bonaldi等[13]研究表明，HMGB1在發(fā)生乙?；揎棤顟B(tài)下才能移位出核，結(jié)合我們前期研究的發(fā)現(xiàn)，機(jī)械牽張可顯著激活p38 MAPK信號(hào)通路，推測(cè)HMGB1出核的分子機(jī)制可能是細(xì)胞在受到機(jī)械牽張刺激后，p38 MAPK被磷酸化激活，磷酸化的p38 MAPK移位入核，通過直接或間接激活HMGB1乙酰化或抑制其去乙?；?，從而引發(fā)HMGB1的主動(dòng)出核過程。然而，HMGB1釋放及其發(fā)揮生物學(xué)功能普遍延遲的機(jī)制目前尚未闡明，這可能與其在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的特點(diǎn)密切相關(guān)。本文中HMGB1-EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體的成功構(gòu)建，為我們進(jìn)一步深入研究HMGB1的相關(guān)生物學(xué)功能提供了可靠、有力的工具。

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Mechanicalstretchinducestranslocationofhigh-mobilitygroupbox1proteininTHP-1cells

DING Ning1, XIAO Hui2, XU Li-xin1, SHE Shou-zhang1

(1DepartmentofAnesthesiologyandAnesthesiologyLaboratory,2DepartmentofOut-patient,GuangzhouFirstMunicipalPeople'sHospital,Guangzhou510180,China.E-mail:dingninggy@hotmail.com)

AIM: To investigate the translocation of high-mobility group box 1 protein(HMGB1) in THP-1 cells induced by mechanical stretch.METHODSThe vector that expressed the fusion protein of HMGB1 and enhanced green fluorescent protein(EGFP) was constructed. The cDNA of HMGB1 and EGFP was subcloned into hemagglutinin(HA)-tagged vector pcDNA3-HA by two-step method. THP-1 cells were transfected with pcDNA3-HMGB1-EGFP and exposed to cyclic mechanical stretch at 20 % elongation using Flexercell 4000T cell stretching unit. The translocation of HMGB1 in THP-1 cells was observed under fluorescence microscope.RESULTSThe recombinant plasmid was verified by enzyme digestion. The green fluorescence accumulated in the nuclei of the cells, indicating that the fusion protein was highly expressed in THP-1 cells and localized in the nuclei. Eighteen hours after mechanical stretch, the green fluorescence was observed in the cytoplasm. At the same time, the green fluorescence was still localized in the nuclei of the control cells treated without mechanical stretch.CONCLUSIONThe HMGB1-EGFP fusion protein is successfully and effectively expressed in THP-1 cells. Mechanical stretch induces the translocation of HMGB1 protein from nucleus to cytoplasm.

Mechanical stretch; High-mobility group proteins; THP-1 cells

R329.2； R563

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-033

1000-4718(2011)02-0382-04

2010-06-08

2010-11-05

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2010B031600011)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.A2009497)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目(No.2009-YB-021)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.2008-ZDi-14)

△通訊作者 Tel: 020-81048310; E-mail: dingninggy@hotmail.com