他克莫司對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制的研究

劉致中， 趙黎明， 武 飛， 岳長久， 李建新

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院泌尿外科， 內(nèi)蒙古 包頭 014010)

他克莫司對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制的研究

劉致中， 趙黎明△， 武 飛， 岳長久， 李建新

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院泌尿外科， 內(nèi)蒙古 包頭 014010)

目的探討他克莫司對(duì)大鼠腎缺血再灌注(I/R)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法將60只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、I/R組和他克莫司處理組,每組各4個(gè)時(shí)點(diǎn)( 0.5 h、2 h、6 h、24 h)。建立腎I/R損傷模型;檢測各組大鼠血清肌酐(Cr)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;用光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腎組織病理變化；用免疫組化法檢測Fas和caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果在相應(yīng)再灌注各時(shí)點(diǎn)，他克莫司處理組血清Cr、TNF-α和MDA水平均低于I/R組(P<0.05)，而他克莫司處理組血清SOD活性高于I/R組(P<0.05)。他克莫司處理組腎組織損傷程度明顯輕于I/R組。與假手術(shù)組比較,I/R組凋亡蛋白Fas和caspase-3表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),而他克莫司處理組凋亡蛋白Fas和caspase-3表達(dá)水平則低于I/R組(P<0.05)。結(jié)論他克莫司能有效抑制I/R引起的自由基產(chǎn)生、腎小管上皮細(xì)胞凋亡以及TNF-α水平降低，表明他克莫司對(duì)大鼠腎I/R損傷具有保護(hù)作用。

他克莫司； 再灌注損傷；腫瘤壞死因子； Fas； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷是臨床常見的病理生理變化, 常見于急性失血、中毒性休克和器官移植手術(shù)等過程中。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。他克莫司是近年來在臨床常用的一種新型免疫抑制劑,新近有文獻(xiàn)報(bào)道新型免疫抑制劑他克莫司在使用過程中,低劑量的他克莫司預(yù)處理可以減輕組織或器官的I/R損傷[1]。本文旨在研究他克莫司對(duì)大鼠腎I/R損傷的保護(hù)作用, 并探討其作用機(jī)制。為他克莫司在臨床上用于腎I/R損傷的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1試劑

他克莫司注射液由安斯泰來制藥有限公司惠贈(zèng)，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。兔抗大鼠Fas和caspase-3(Lab Vision)，Ⅱ抗免疫組化試劑盒購于天津津脈基因測繪技術(shù)有限公司。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用健康雄性Wistar大鼠60只(購自內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，重量220-260 g。隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(sham)組、I/R組和他克莫司處理(FK506+I/R)組,每組20只動(dòng)物，各組又按時(shí)相不同分為0.5 h、2 h、6 h、24 h 4個(gè)亞組, 每個(gè)亞組5只動(dòng)物。

2.2動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本采集 建立動(dòng)物模型，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，將大鼠以20%烏拉坦5 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，作腹部正中切口，切除右腎，小心分離左腎動(dòng)脈，保護(hù)輸尿管，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈,45 min后恢復(fù)灌流，腎臟由暗紅色變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功。假手術(shù)組開腹后切除右腎, 分離左腎動(dòng)脈, 但不夾閉左腎動(dòng)脈；I/R組建立腎臟I/R損傷模型, 并于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射生理鹽水1 mL;他克莫司處理組建立腎臟I/R損傷模型，并于手術(shù)前6 h從尾靜脈注射他克莫司注射液( 0.5 mg/kg)；于再灌注后0.5 h、2 h、6 h、24 h 處死動(dòng)物,處死前下腔靜脈采血3 mL以備進(jìn)行腎功能及血清TNF-α、MDA、SOD指標(biāo)測定。并切除左腎,切除的左腎部分組織用10%中性甲醛固定以制備石蠟切片。

2.3血清肌酐(creatinine,Cr)、TNF-α、MDA含量和SOD活性的測定 從下腔靜脈取血3 mL, 離心后取血清。Cr采用全自動(dòng)生化分析儀測定，TNF-α含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，MDA含量和SOD活性采用化學(xué)比色法，均按檢測試劑盒說明書操作。

2.4病理組織學(xué)觀察 切除的左腎部分腎組織于10%中性甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4 μm厚的連續(xù)冠狀石蠟切片。按病理學(xué)常規(guī)制片、HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察腎組織損傷情況。

2.5免疫組化檢測Fas和caspase-3的表達(dá) 切取4 μm厚的石蠟切片, 常規(guī)脫蠟至水。嚴(yán)格按兔二步法免疫組化試劑盒操作。Fas和caspase-3陽性細(xì)胞結(jié)果為胞漿內(nèi)呈黃色或棕黃色染色，陰性對(duì)照以PBS代替Ⅰ抗。每張切片隨機(jī)采集5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞數(shù)為0，記作“-”;陽性細(xì)胞數(shù)25%以下為“+”;陽性細(xì)胞數(shù)25%-50%為“++”;陽性細(xì)胞數(shù)51%-75%為“+++”;陽性細(xì)胞數(shù)75%以上為“++++”。將表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分，“+”為1分，“++”為2分，“+++”為3分，“++++”為4分。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1血清Cr和TNF-α含量的變化

在相應(yīng)再灌注各時(shí)點(diǎn)，I/R組與他克莫司處理組大鼠Cr值均高于假手術(shù)組；隨著再灌注時(shí)間的延長，I/R組Cr值明顯升高；在再灌注2 h、6 h和24 h，他克莫司處理組Cr的水平顯著低于I/R組(P<0.05)，I/R組Cr的水平與假手術(shù)組比差異顯著(P<0.05)，見表1。隨著再灌注時(shí)間的延長，I/R組血清TNF-α含量明顯升高；而他克莫司處理組隨著再灌注時(shí)間延長血清TNF-α含量升高不明顯，再灌注24 h，TNF-α含量反而出現(xiàn)降低；在再灌注各時(shí)點(diǎn)，他克莫司處理組TNF-α含量均顯著低于I/R組(P<0.05)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)各組不同再灌注時(shí)點(diǎn)Cr和TNF-α水平比較

2血清MDA含量和SOD活性的變化

與同一時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組比較, I/R組大鼠血清MDA含量較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)；在再灌注相應(yīng)時(shí)點(diǎn)他克莫司處理組血清MDA含量低于I/R組(P<0.05)。在相應(yīng)再灌注各時(shí)點(diǎn)，與假手術(shù)組比較, I/R組血清SOD活性顯著降低(P<0.05)；他克莫司處理組血清SOD與I/R組比較，差異顯著(P<0.05)；在再灌注6 h、24 h，假手術(shù)組與他克莫司處理組也有顯著差異,見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)各組不同再灌注時(shí)點(diǎn)血清MDA含量和SOD活性的比較

3腎組織病理變化

光鏡下，假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常; I/R 組和他克莫司處理組在恢復(fù)再灌注后的0.5-2 h腎間質(zhì)血管內(nèi)都有充血表現(xiàn)，其中以0.5 h表現(xiàn)明顯。以后充血表現(xiàn)逐漸改善。I/R 組在再灌注6 h、24 h出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞腫脹,細(xì)胞脫落,腎間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血伴炎癥細(xì)胞浸潤; 24 h小管形態(tài)損傷最嚴(yán)重，腎小管輪廓結(jié)構(gòu)消失，有的出現(xiàn)不同程度的片狀壞死。而他克莫司處理組病變程度較I/R 組明顯減輕，僅出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of renal tissues at 24 h(×400).A:sham group; B:I/R group; C: FK506+I/R group.

4他克莫司對(duì)Fas蛋白表達(dá)的影響

Fas陽性細(xì)胞表達(dá)為胞漿內(nèi)呈黃色或棕黃色染色，陽性表達(dá)主要在腎小管上皮細(xì)胞以近曲小管、遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞明顯，腎小球未見表達(dá)。I/R 組在再灌注的各時(shí)點(diǎn)表達(dá)均高于假手術(shù)組，在再灌注2 h、6 h、24 h，F(xiàn)as蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，I/R組和他克莫司處理組的差異顯著(P<0.05)；再灌注6 h、24 h假手術(shù)組與他克莫司處理組差異顯著(P<0.05)，見圖2、表3。

5他克莫司對(duì)caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)為胞漿內(nèi)呈黃色或棕黃色染色，陽性表達(dá)主要在腎小管上皮細(xì)胞以近曲小管、遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞明顯，腎小球未見表達(dá)。I/R 組在再灌注的各時(shí)點(diǎn)表達(dá)均高于假手術(shù)組，在再灌注2 h、6 h、24 h，caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，I/R組和他克莫司處理組的差異顯著(P<0.05)；再灌注24 h假手術(shù)組與他克莫司處理組差異顯著(P<0.05)，見圖3、表3。

Figure 2. Fas expression detected by immunohistochemistry at 24 h(×400). A: sham group; B:I/R group; C: FK506+I/R group.

Figure 3. Caspase-3 expression detected by immunohistochemistry at 24 h(×400). A:sham group; B:I/R group; C:FK506+I/R group.

表3 實(shí)驗(yàn)各組不同再灌注時(shí)點(diǎn)腎組織Fas和caspase-3表達(dá)強(qiáng)度(分)的變化

討 論

他克莫司是從Tsukubaensis鏈球菌中提取出來的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過抑制T輔助細(xì)胞釋放IL-2及T殺傷細(xì)胞的增殖，從而抑制細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，是近年來在器官移植中運(yùn)用比較廣泛的一種新型免疫抑制劑[1]，研究發(fā)現(xiàn)它不僅能減輕再灌注后腎臟損傷的程度，而且能夠使損傷后的腎臟得到一定程度的修復(fù)和再生[2]。

近年研究表明，炎性細(xì)胞因子在腎I/R損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其中TNF-α是參與腎I/R損傷的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。腎I/R損傷時(shí)，TNF-α作為炎癥細(xì)胞因子被釋放，通過直接的細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)腎小球纖維蛋白沉積、收縮血管以致腎小球?yàn)V過率下降以及聚集中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等亦能導(dǎo)致腎臟損傷[3,4]。因此，阻斷炎性細(xì)胞因子的釋放可能是減少I/R損傷的一條途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I/R組不同再灌注時(shí)點(diǎn)TNF-α水平明顯高于他克莫司處理組(P<0.05)，說明術(shù)前給予他克莫司預(yù)處理，可以降低I/R腎組織TNF-α水平，從而減輕腎I/R損傷程度。

氧自由基學(xué)說在腎I/R損傷機(jī)制中的作用已經(jīng)得到廣泛證實(shí)，在腎I/R過程中，氧自由基的大量形成和脂質(zhì)過氧化的增加是細(xì)胞損傷的主要病理過程之一。SOD是自由基的重要清除劑之一，也是體內(nèi)非常重要的抗氧化酶[5，6]。缺血再灌注的過程中，腎臟組織會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，而腎臟內(nèi)的SOD等氧自由基清除劑因?yàn)槿毖毖跻种屏似浠钚裕荒苡行У厍宄踝杂苫?，以致氧自由基大量堆積。氧自由基能夠損傷生物膜上的脂質(zhì)，最終產(chǎn)生MDA，MDA也有細(xì)胞毒性作用，從而加劇I/R損傷[7]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，他克莫司處理組MDA含量明顯低于I/R組(P<0.05)，SOD活性明顯高于I/R組(P<0.05)。I/R組血Cr明顯高于他克莫司處理組。這表明他克莫司提高了SOD 的活性，保存有較好的氧自由基清除能力，能夠減輕I/R對(duì)腎組織的損傷。

研究表明[8],腎I/R損傷后除發(fā)生細(xì)胞壞死外,細(xì)胞凋亡也是其重要的死亡形式。細(xì)胞凋亡受多種凋亡相關(guān)基因及其蛋白的調(diào)控,Fas及其配體FasL同屬于TNF家族成員,當(dāng)細(xì)胞表面表達(dá)Fas時(shí),可激活FasL使兩者結(jié)合,使Fas死亡區(qū)交聯(lián),產(chǎn)生神經(jīng)酰胺,通過某種途徑,激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶,引起細(xì)胞凋亡,并向細(xì)胞內(nèi)傳遞死亡信號(hào),數(shù)小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9，10]。在很多病理?xiàng)l件下,凋亡相關(guān)蛋白Fas可通過激活caspase-3而介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Caspase-3是人類白細(xì)胞介素1β轉(zhuǎn)化酶家族的重要成員之一,是激活細(xì)胞凋亡早期階段的關(guān)鍵蛋白酶,并在細(xì)胞凋亡過程中起著中心環(huán)節(jié)的作用?；罨腸aspase-3可通過水解特異性蛋白底物,從多方面促進(jìn)凋亡的發(fā)生。如對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白及看家蛋白actin、fodrin keratin等的水解,使細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞[11]，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, I/R組Fas和caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高,說明阻斷腎臟血運(yùn)后，在恢復(fù)再灌注期間可以誘導(dǎo)腎臟Fas和caspase-3蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡。Fas和caspase-3蛋白于實(shí)驗(yàn)各組腎小管上皮細(xì)胞均有表達(dá),以腎近曲小管和遠(yuǎn)曲小管表達(dá)較明顯,而腎小球未見表達(dá)。進(jìn)一步觀察,與假手術(shù)組相比, I/R組Fas和caspase-3在缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng),陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加;經(jīng)他克莫司預(yù)處理后,腎小管上皮細(xì)胞Fas和caspase-3不僅表達(dá)強(qiáng)度顯著減弱,而且陽性細(xì)胞數(shù)也明顯減少。上述結(jié)果提示,他克莫司具有抑制Fas和caspase-3表達(dá)的作用,從而減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述,他克莫司能通過降低腎I/R損傷時(shí)TNF-α和MDA水平，提高SOD活性，保護(hù)腎功能，并抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)大鼠腎I/R損傷具有一定的保護(hù)作用。

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Effectoftacrolimusonrenalischemia/reperfusioninjuryinrats

LIU Zhi-zhong, ZHAO Li-ming, WU Fei, YUE Chang-jiu, LI Jian-xin

(DepartmentofUrology,TheThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege,Baotou014010,China.E-mail:zhao_55liming@sina.com)

AIM: To investigate the protective effects and mechanism of tacrolimus on renal ischemia/reperfusion(I/R) injury in rats.METHODSSixty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: sham-operated group, I/R group and tacrolimus group. After the renal I/R injury model was established, the serum content of creatinine(Cr), tumor necrosis factor-α(TNF-α)and malondialdehyde(MDA) and activity of superoxide dismutase(SOD) were measured at reperfusion time points of 0.5 h, 2 h, 6 h and 24 h. The renal histopathological lesions and the expression of Fas and caspase-3 were observed by the methods of microscopy and immunohistochemistry, respectively.RESULTSAt all the 4 time points, the levels of Cr, TNF-α and MDA in tacrolimus group were lower than those in I/R group(P<0.05). The SOD activity in tacrolimus group was higher than that in I/R group. Compared with I/R group, the renal histopathological lesions were improved, and the levels of Fas and caspase-3 were significantly decreased in tacrolimus group(P<0. 05).CONCLUSIONTacrolimus inhibits the production of free radical, the expression of TNF-α and apoptosis of renal tubular epithelial cells in renal I/R injury in rats, indicating that tacrolimus has protective function against renal I/R injury.

Tacrolimus; Reperfusion injury; Tumor necrosis factor; Fas; Caspase-3

R697

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-034

1000-4718(2011)02-0386-04

2010-06-18

2010-11-19

△ 通訊作者 Tel:0472-5992751; E-mail: zhao_55liming@sina.com