siRNA沉默LBH基因促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞周期進(jìn)展*

劉啟才， 王穎峰， 楊春祥， 李曉艷, 彭 燕, 彭 杰, 李 冰， 李 立

(1廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510182； 2荊門市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 荊門 448000；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，4華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)腫瘤防治中心影像介入科， 廣東 廣州 510060)

siRNA沉默LBH基因促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞周期進(jìn)展*

劉啟才1△， 王穎峰1， 楊春祥2， 李曉艷3, 彭 燕1, 彭 杰1, 李 冰1， 李 立4△

(1廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510182；2荊門市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 湖北 荊門 448000；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，4華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)腫瘤防治中心影像介入科， 廣東 廣州 510060)

目的利用合成的小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，觀察LBH(limb-bud and heart) 基因表達(dá)下調(diào)對16HBE細(xì)胞周期及相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染靶向LBH基因的siRNA到16HBE細(xì)胞，熒光定量RT-PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染后LBH基因表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測LBH基因沉默后16HBE 細(xì)胞周期的改變，熒光定量RT-PCR及Western blotting檢測LBH基因沉默后細(xì)胞周期素E1和E2表達(dá)水平。結(jié)果50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞48 h后,LBH基因的表達(dá)水平只有對照組的14%；siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞48 h，其G1期細(xì)胞百分率比對照組減少9.28%，而S期細(xì)胞百分比增加14.08%；16HBE細(xì)胞在50 nmol/L siRNA的轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞周期素E2的表達(dá)水平為對照組的2倍，而細(xì)胞周期素E1的表達(dá)沒有發(fā)生明顯改變。結(jié)論靶向于LBH基因的siRNA能有效沉默16HBE細(xì)胞中LBH基因的表達(dá)，LBH基因的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)了16HBE細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)展；細(xì)胞周期素E2的表達(dá)上調(diào)參與了LBH沉默導(dǎo)致的細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)展。

RNA干擾； 基因,LBH； 16HBE細(xì)胞； 細(xì)胞周期

應(yīng)用抑制性消減雜交獲得鼻咽癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)基因表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags,ESTs) NP9(GenBank No.BF718797)[1,2]，通過序列同源比對，發(fā)現(xiàn)其序列與肢體及心臟早期發(fā)育過程中一種保守核蛋白表達(dá)基因(limb-bud and heart,LBH)[3]的同源性高達(dá)99%。研究發(fā)現(xiàn)LBH基因是脊椎動物中一個(gè)序列高度保守的組織特異性轉(zhuǎn)錄共活化因子(co-activator)，其在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[3-5]。前期研究結(jié)果提示與LBH同源的NP9基因的表達(dá)可通過下調(diào)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)來抑制鼻咽癌細(xì)胞的裸鼠成瘤[6]，而對其在腫瘤發(fā)生中的作用和機(jī)制所知甚少。我們以LBH基因正常表達(dá)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE為模型[1]，通過基因沉默技術(shù)使LBH表達(dá)下調(diào)，觀察其沉默對16HBE細(xì)胞周期的影響并初步分析其機(jī)制，為闡明LBH基因的功能和探討該基因下調(diào)在腫瘤發(fā)病中的作用提供必要的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細(xì)胞系 人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心保存和復(fù)蘇。

1.2主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及總RNA提取試劑Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品；熒光定量RT-PCR試劑盒為Stratagen產(chǎn)品。抗cyclin E1多克隆抗體為Alphagenix產(chǎn)品、抗cyclin E2及抗GAPDH抗體購自CST。

2方法

2.1siRNA合成 根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)原則，利用Ambion公司網(wǎng)站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder)提供的siRNA設(shè)計(jì)工具，獲得沉默LBH基因(GenBank No. NM_030915)的靶序列AAGATGACTGAGGTGATGATG，根據(jù)靶序列合成正義和反義RNA鏈，序列分別為5′- GAUGACUGAGG UGAUGAUGTT -3′和3′- TTCUACUGACUCCACUACUAC -5′。提交序列給Ambion公司合成dsRNA.

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 16HBE細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。處于對數(shù)增長期的16HBE細(xì)胞按3×106cells/well接種6孔板后常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%融合度時(shí)，分別以25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L的特異siRNA及非特異siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,非特異siRNA用來陰性對照。轉(zhuǎn)染時(shí)每孔按對應(yīng)的濃度取一定量的siRNA和4 μL Lipofectamine 2000分別溶于250 μL無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中，待Lipofectamine 2000溶解5 min后，將脂質(zhì)體溶液與siRNA溶液混合，室溫放置20 min，最后將兩者的混合液加入含2 mL的完全培養(yǎng)液的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中，24 h后更換新培養(yǎng)基，并分別于轉(zhuǎn)染24 h和48 h后收集細(xì)胞。

2.3熒光定量 RT-PCR檢測LBH基因表達(dá) 設(shè)計(jì)人LBH基因和人GAPDH基因熒光定量RT-PCR引物(序列見表1)。提交引物序列給TaKaRa公司合成。按方法2.2最后收集的細(xì)胞加1 mL Trizol試劑裂解，提取細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA，按照Thermoscript first cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，然后以cDNA為模板，進(jìn)行LBH基因、GAPDH基因的熒光定量RT-PCR反應(yīng)。熒光定量RT-PCR采用SYBR green I法，反應(yīng)體系包括： 2×master mix 25 μL； 2 μmol/L(上游+下游)引物 5 μL，100×ROX 0.5 μL，cDNA產(chǎn)物 2 μL，反應(yīng)在Stratagen Mx3000p上進(jìn)行，運(yùn)行條件為：先94 ℃ 10 min， 然后 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的第2步結(jié)束后收集熒光信號，以熒光信號對反應(yīng)循環(huán)數(shù)作圖。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值，通過ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中LBH基因的相對表達(dá)水平。

2.4細(xì)胞周期分析 以確定沉默LBH的有效siRNA量再次轉(zhuǎn)染16HBE 細(xì)胞，于48 h后0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，冰冷PBS清洗2次后，預(yù)冷的70%乙醇固定，4 ℃過夜，上機(jī)前離心除去乙醇，PBS清洗3次，100 mg/L RNase A 37 ℃消化40 min；50 g/L PI 4 ℃染色1 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量，確定siRNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞周期的影響。

2.5熒光定量RT-PCR檢測細(xì)胞周期素E1和E2 收集50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的16HBE細(xì)胞和對照組細(xì)胞，Trizol提取總RNA，然后用設(shè)計(jì)的細(xì)胞周期素E1和 E2 的引物(序列見表1)，按照方法2.3的操作和反應(yīng)條件對實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的細(xì)胞周期素E1和 E2的表達(dá)進(jìn)行熒光定量RT- PCR檢測，確定實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中細(xì)胞周期素E1和E2的表達(dá)改變。

2.6Western blotting檢測細(xì)胞周期素E1和E2的表達(dá) 4.5×106個(gè)細(xì)胞接種25 cm2培養(yǎng)瓶，第2 d用50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染，48 h后收集轉(zhuǎn)染siRNA的16HBE細(xì)胞和對照組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS(pH 7.4)洗3次，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，超聲處理，BCA蛋白分析試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度，取80 μg蛋白上樣，進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜(cyclin E1、cyclin E2及GAPDH的稀釋度分別是：1∶500、1∶500和1∶1 000)，1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，加入發(fā)光底物，X光膠片感光，顯影和定影。

表1 熒光定量PCR的引物序列

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1siRNA轉(zhuǎn)染后LBH基因的表達(dá)

siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞后24 h，相對對照組(對照組為非特異性dsRNA)，25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L dsRNA轉(zhuǎn)染組均沒有發(fā)現(xiàn)LBHmRNA出現(xiàn)顯著下調(diào)。轉(zhuǎn)染48 h后，25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的LBH表達(dá)下調(diào)，以50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染組最為顯著(P<0.05)，其LBHmRNA水平只有對照組細(xì)胞的14%，見圖1， siRNA濃度達(dá)到100 nmol/L，LBH表達(dá)水平未見更明顯的下調(diào)。

Figure 1. The relative expression of LBH mRNA detected by real-time RT-PCR after siRNA transfection for 24 h and 48 h.±s. n=6.*P<0.05 vs control.

2細(xì)胞周期的改變

50 nmol/L siRNA 轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞48 h，與對照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期細(xì)胞百分比減少和S期細(xì)胞百分比增加，G1期細(xì)胞從對照組的67.30%減少為58.02%，S期細(xì)胞從對照組的21.54%增加到35.62%,見圖2，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)展。

Figure 2. The effect of LBH gene silencing on the 16HBE cell cycle.A:control;B:siRNA.

3LBH表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞周期素E1和E2表達(dá)的影響

50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞48 h后，熒光定量RT-PCR檢測顯示，以對照組細(xì)胞中細(xì)胞周期素E1和E2的表達(dá)水平為100%，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中細(xì)胞周期素E1相對表達(dá)量為106%，而細(xì)胞周期素E2表達(dá)達(dá)到對照組的1.89倍,見圖3。對蛋白表達(dá)的檢測顯示：50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染48 h的16HBE細(xì)胞，其細(xì)胞周期素E2相對表達(dá)水平為對照組2.06倍(P<0.05)；細(xì)胞周期素E1蛋白的表達(dá)水平在沉默組和對照組之間差異不顯著(P>0.05),見圖4。

討 論

鼻咽癌組織中的低水平表達(dá)LBH蛋白，因其在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)普遍表達(dá)下調(diào)，并且在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)LBH后能抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長和裸鼠致瘤，從而推測LBH為鼻咽癌易感基因的候選者[1,2,6]。因此通過構(gòu)建LBH表達(dá)下調(diào)的上皮細(xì)胞模型，確定LBH表達(dá)下調(diào)對上皮細(xì)胞的影響，能夠有效揭示LBH表達(dá)缺失在鼻咽癌中的作用。目前RNAi(RNA interference)是最有效的基因沉默技術(shù)，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)蛋白表達(dá)[7,8]。

我們以LBH基因正常表達(dá)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE為模型，采用體外合成的靶向于LBH基因的siRNA，在轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞后，通過LBHmRNA表達(dá)水平的檢測確定了沉默LBH基因的條件，藉此成功建立了LBH表達(dá)下調(diào)的16HBE的細(xì)胞模型。由于前期結(jié)果證實(shí)對細(xì)胞周期的影響與LBH基因的抑瘤功能有關(guān)[6]，而且基因芯片檢測提示表達(dá)LBH鼻咽癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期素E2的表達(dá)顯著下調(diào)[9]，因此在LBH基因沉默后，對細(xì)胞周期進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示16HBE細(xì)胞在LBH沉默后表現(xiàn)為細(xì)胞周期G1/S期進(jìn)展的加速，確定了LBH基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用。

Figure 3. The relative expression of cyclin E1 and E2 mRNA examined by real-time RT-PCR after siRNA transfection for 48 h.±s.n=6.*P<0.05 vs negative control.

Figure 4. The expression of protein cyclin E1 and E2 after siRNA transfection for 48 h.±s. n=6. *P<0.05 vs negative control.

通常認(rèn)為在細(xì)胞周期的進(jìn)展中，當(dāng)細(xì)胞通過G1期后就會到達(dá)受CDK2控制的G1/S期檢測點(diǎn)，在此檢測點(diǎn)，細(xì)胞周期素E1和E2與CDK2結(jié)合形成的復(fù)合物通過誘導(dǎo)RB蛋白的磷酸化推動細(xì)胞進(jìn)入S期，因此細(xì)胞周期素E1和E2在細(xì)胞周期G1/S期進(jìn)展中起重要作用[10]。16HBE細(xì)胞中的LBH基因沉默后，實(shí)際上僅僅表現(xiàn)為細(xì)胞周期素E2的表達(dá)上調(diào)，而細(xì)胞周期 E1沒有發(fā)生明顯改變，說明LBH對細(xì)胞周期素E2的特異調(diào)控。在原發(fā)性乳腺癌、卵巢癌、子宮癌和肺癌中均發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞周期素E2的表達(dá)上調(diào)，表明其在腫瘤發(fā)生中的重要作用[11,12]。因此在上皮細(xì)胞中LBH對細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控一定程度地揭示了LBH下調(diào)在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制。

[1] 劉啟才, 方 嬿, 李曉艷,等. NP9基因的克隆及對細(xì)胞周期素D1轉(zhuǎn)錄活性的影響[J].癌癥, 2003, 22(7):725-728.

[2] 劉啟才, 李曉艷, 韋拔雄,等. NP9基因在鼻咽癌中的表達(dá)及對CNE1細(xì)胞生長的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 84(12):1009-1011.

[3] Briegel KJ, Joyner AL. Identification and characterization of Lbh, a novel conserved nuclear protein expressed during early limb and heart development[J]. Dev Biol, 2001,233(2):291-304.

[4] Briegel KJ, Baldwin HS, Joyner AL, et al. Congenital heart disease eminiscent of partial trisomy 2p syndrome in mice transgenic for the transcription factor Lbh[J].Development, 2005,132(17):3305-3316.

[5] Conen KL, Nishimori S, Kronenberg HM, et al. The transcriptional cofactor Lbh regulates angiogenesis and endochondral bone formation during fetal bone development[J]. Dev Biol, 2009,333(2):348-358.

[6] 劉啟才, 李曉艷, 韋拔雄,等. NP9基因抑制鼻咽癌細(xì)胞成瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華腫瘤雜志,2005, 27(11):641-644.

[7] Hannon GJ. RNA interference [J]. Nature, 2002, 418(6894):244 -251.

[8] 賈明旺,黃文杰.Caspase-3基因沉默對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(1):132-136.

[9] 劉啟才,李曉艷,彭 燕,等.NP9基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞系CNE1基因表達(dá)譜的影響[J].中國病理生理雜志,2008,24(5):982-985.

[10]Müller-Tidow C, Metzger R, Kügler K, et al. Cyclin E is the only cyclin-dependent kinase 2-associated cyclin that predicts metastasis and survival in early stage non-small cell lung cancer[J].Cancer Res,2001,61(2):647-653.

[11]Moroy T, Geisen C. Cyclin E[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004,36(8):1424-1439.

[12]Payton M, Scully S, Chung G, et al.Deregulation of cyclin E2 expression and associated kinase activity in primary breast tumors[J]. Oncogene, 2002, 21(55): 8529-8534.

RNAi-mediatedknocking-downofLBHgenepromotescellcycleprogressin16HBEcells

LIU Qi-cai1, WANG Ying-feng1, YANG Chun-xiang2, LI Xiao-yan3, PENG Yan1, PENG Jie1, LI Bing1, LI Li4

(1ExperimentMedicalResearchCenter,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510182,China;2DepartmentofNeurology,TheSecondHospitalofJingmenCity,Jingmen448000,China;3DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospital,4StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthernChina,ImagingDiagnosisandInterventionalCenter,CancerCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail:liuqicai968@yahoo.com.cn;li2@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of small interfering RNA(siRNA) on limb-bud and heart(LBH) gene expression in 16HBE cells, and further to observe the change of 16HBE cell cycle after knocking down ofLBHgene.METHODSSynthetical siRNA targetingLBHgene was transfected into 16HBE cells by the method of lipofectamine 2000. The mRNA expression ofLBHwas examined by real time RT-PCR. The cell cycle was assayed by flow cytometry. The expression of cyclin E1 and E2 was also detected by real time RT-PCR and Western blotting.RESULTSThe expression ofLBHgene decreased by 86% in 16HBE cells transfected with 50 nmol/L of siRNA for 48 h. After transfected with siRNA for 48 h, 16HBE cells in G1phase decreased by 9.28% and the cells in S phase increased by 14.08%. The expression level of cyclin E2 in 16HBE cells transfected with siRNA was twice higher than that of the negative control cells.CONCLUSIONSequence-specific siRNA targetingLBHis capable of suppressingLBHgene expression in 16HBE cells. Down-regulation ofLBHexpression in 16HBE cells may promote the progress of cell cycle, and up-regulation of cyclin E2 expression plays a role in the process of G1/S phase.

RNA interference; Genes,LBH; 16HBE cells; Cell cycle

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-027

1000-4718(2011)02-0357-04

2010-09-01

2010-11-30

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.06301124)；廣州市屬高校科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.61093)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81071207)

△通訊作者 Tel：020-81340204；E-mail:liuqicai968@yahoo.com.cn；Tel：020-87343476；E-mail:li2@mail.sysu.edu.cn