三種方法提取不同品種梨葉片總RＮA

鞏艷明 曹后男 宗成文 金燦 許雪

摘要：為篩選出提取梨葉片總ＲＮＡ的最佳方法，以梨極矮化突變體和蘋(píng)果梨為材料，采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒、ＳＤＳ法和改良ＣＴＡＢ法提取其葉片總ＲＮＡ并比較提取效果。結(jié)果表明，改良ＣＴＡＢ法能有效抑制酚類(lèi)物質(zhì)和多糖對(duì)總ＲＮＡ提取的影響，獲得純度高、完整性好的總ＲＮＡ，其２８ Ｓ ｒＲＮＡ條帶亮度高于１８ Ｓ ｒＲＮＡ，所提取的ＲＮＡ適合下一步的研究使用。

關(guān)鍵詞：梨；ＲＮＡ提??；柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒；改良ＣＴＡＢ法；ＳＤＳ法

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ６６１．２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）15－3204-03

Three Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｐｅａｒ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ

ＧＯＮＧ Ｙａｎ－ｍｉｎｇ，ＣＡＯ Ｈｏｕ－ｎａｎ，ＺＯＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｗｅｎ，ＪＩＮ Ｃａｎ，ＸＵ Ｘue

（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｙａｎbｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ １３３００２，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｈｏｏｓｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ ｌｅａｖｅｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔs ｏｆ Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡｏｕｔ， ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｐｅａｒ ｄｗａｒｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ Ｐｉｎｇｇｕｏｌｉ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ａｓ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｇｏｔ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ of ＲＮＡ． Ｔｈｅ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｎｄ ｏｆ ２８Ｓ ｒＲＮＡ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ １８Ｓ ｒＲＮＡ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａｒ； ＲＮＡ extraction； Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡｏｕｔ； ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ

根據(jù)植物不同種屬或組織間各異的生理特性篩選出適宜的ＲＮＡ提取方法，是提取完整性好、純度高的ＲＮＡ，進(jìn)而進(jìn)行基因克隆與表達(dá)分析的前提［１］。木本植物的組織和細(xì)胞有厚實(shí)且堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，較多的單寧、酚、醌等次生代謝物質(zhì)以及蛋白質(zhì)、多糖等有機(jī)大分子［２］。在ＲＮＡ提取過(guò)程中，這些物質(zhì)中有的會(huì)與ＲＮＡ不可逆地結(jié)合，有的會(huì)與ＲＮＡ共同沉淀下來(lái)，不僅降低提取效率，而且嚴(yán)重干擾后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、酶切反應(yīng)和體外擴(kuò)增［３－５］。因此，快速且高效地沉淀ＲＮＡ、抑制ＲＮＡ酶的活性、去除多糖和其他次生代謝物質(zhì)，是ＲＮＡ提取的關(guān)鍵［６］。

梨極矮化突變體是在延邊小香水梨實(shí)生后代中偶然發(fā)現(xiàn)的實(shí)生矮化突變體，其抗寒性強(qiáng)于Ｓ２、ＯＨ×Ｆ５１、ＯＨ×Ｆ６９和ＰＤＲ５４等砧木，且抗病性也較強(qiáng)，是梨屬植物中少有的既矮化又具有較強(qiáng)抗性的資源［７］。與蘋(píng)果梨、小香水、南國(guó)梨等品種相比，極矮化種質(zhì)的葉片較大、葉色濃綠、質(zhì)地較厚，含有更多的酚類(lèi)和多糖。針對(duì)以上特點(diǎn)，本研究分析比較了柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒、改良ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取梨極矮化突變體和蘋(píng)果梨葉片總ＲＮＡ的效果，以期為多酚多糖植物葉片總ＲＮＡ的提取提供參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１實(shí)驗(yàn)材料梨極矮化突變體葉片、蘋(píng)果梨葉片，采自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹(shù)試驗(yàn)場(chǎng)，液氮速凍后

－７０ ℃低溫冰箱保存。

１．１．２試劑柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶Ｍ－ＭＬＶ（ＲＮａｓｅ Ｈ－）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（ＣＴＡＢ）、焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、β－巰基乙醇（ＢＭＥ）、十二烷基硫酸鈉（ＳＤＳ）購(gòu)自長(zhǎng)春市德雙科技有限責(zé)任公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

１．２方法

１．２．１葉片總ＲＮＡ的提取及檢測(cè)采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒、改良ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法３種方法提取葉片總ＲＮＡ，取所得產(chǎn)物２ μＬ，經(jīng)１％瓊脂糖凝膠（含ＥＢ ０．５ μｇ／ｍL），１２０ Ｖ恒壓電泳１５ ｍｉｎ檢測(cè)總ＲＮＡ的質(zhì)量。具體提取方法如下：

１）試劑盒法：參照柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

２）ＣＴＡＢ法：參考Ｃｈａｎｇ等［８］的方法并略作改動(dòng)，具體步驟如下：①取８０ ｍｇ左右樣品，在液氮中研磨成粉末后迅速裝入１．５ ｍＬ離心管中，加入７００ μＬ ６５ ℃預(yù)熱的提取緩沖液［１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，２％ ＣＴＡＢ， ２％ ＰＶＰ，２％～３％ β－巰基乙醇（用前加入）］，渦旋２～３ ｍｉｎ，６５ ℃水?。玻啊常?ｍｉｎ，中途渦旋２～３次；②加入提取緩沖液０．６倍體積的氯仿，渦旋２～３ ｍｉｎ；③４ ℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；④轉(zhuǎn)移上清液至新的１．５ ｍＬ離心管，加入１／３體積預(yù)冷的１０ ｍｏｌ／Ｌ ＬｉＣｌ，混合均勻，－２０ ℃沉淀１ ｈ；⑤重復(fù)步驟③，棄上清；⑥７５％乙醇清洗沉淀后，加入５００ μＬ ０．１％的ＤＥＰＣ水溶解沉淀；⑦加入０．８倍體積酚與氯仿（體積比為１∶１）渦旋２ ｍｉｎ，室溫靜置５ ｍｉｎ；⑧重復(fù)步驟③；⑨轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)新的離心管，并加等體積氯仿抽提１次，上清中加１／１０體積的５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．８）和２～２．５倍冷無(wú)水乙醇，－２０ ℃沉淀１ ｈ；⑩１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，收集ＲＮＡ，７５％乙醇清洗沉淀１～２次，風(fēng)干，加入２０～３０ μＬ ０．１％的ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，－７０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

３）ＳＤＳ法：參考王壯偉等［９］的方法進(jìn)行。

１．２．２ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增梨Ａｃｔｉｎ基因以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８為反轉(zhuǎn)錄引物，１ μｇ改良ＣＴＡＢ法提取的總ＲＮＡ為模板，Ｍ－ＭＬＶ（ＲＮａｓｅ Ｈ－）反轉(zhuǎn)錄酶催化合成ｃＤＮＡ第一鏈，具體操作按反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)ＧｅｎＢａｎｋ登錄的西洋梨Ａｃｔｉｎ基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物：ＰｂＡＣＴＦ：５ＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴ

ＣＣ３，ＰｂＡＣＴＲ：５ＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧ３。ＰＣＲ反應(yīng)體系為２５ μＬ，含模板第一鏈ｃＤＮＡ １ μＬ，上下游引物各１．５ μＬ（１０ μｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １．５ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．２ μＬ（５ Ｕ／μＬ），１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，其余用去離子水補(bǔ)充。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９４ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性４５ ｓ，６０ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)；７２ ℃，５ ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

２結(jié)果與分析

２．１３種方法提取的葉片總ＲＮＡ質(zhì)量

３種方法所提取的蘋(píng)果梨總ＲＮＡ均有較明顯的２８ Ｓ、１８ Ｓ和較弱的５ Ｓ條帶出現(xiàn)，而除了改良ＣＴＡＢ法外，其他兩種方法均不能提取出高質(zhì)量的梨極矮化突變體總ＲＮＡ（圖１～３）。由圖１、圖２可以看出采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ試劑盒和ＳＤＳ法提取的梨極矮化突變體ＲＮＡ條帶較暗，其中圖２－Ａ ４條泳道中僅前兩條有ＲＮＡ條帶，排除操作因素后，多次實(shí)驗(yàn)證明ＳＤＳ法提取效果不穩(wěn)定；此外這兩種方法提取的ＲＮＡ條帶雖然較亮，但２８ Ｓ和１８ Ｓ條帶亮度基本相同，顯示存在降解現(xiàn)象。另外這兩種方法均有蛋白質(zhì)和ＤＮＡ等雜質(zhì)的殘留。

從圖３可以看出，ＣＴＡＢ法提取的梨極矮化突變體和蘋(píng)果梨葉片總ＲＮＡ條帶均很亮，且２８ Ｓ條帶比１８ Ｓ條帶亮，沒(méi)有觀察到蛋白質(zhì)或ＤＮＡ雜質(zhì)的殘留，得到的ＲＮＡ質(zhì)量較高。但是圖３－Ａ中１、２泳道的條帶不規(guī)則，說(shuō)明可能有少量多糖存在，而圖３－Ｂ中１～４泳道的條帶均完整規(guī)則，說(shuō)明ＣＴＡＢ法提取的蘋(píng)果梨總ＲＮＡ質(zhì)量比梨極矮化突變體總ＲＮＡ要好，且多次操作穩(wěn)定性較強(qiáng)。

２．２Ａｃｔｉｎ基因的ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果

以改良ＣＴＡＢ法提取的ＲＮＡ為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用特異引物擴(kuò)增Ａｃｔｉｎ基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為２５０ ｂｐ，與預(yù)期相符（圖４）。說(shuō)明所提取的ＲＮＡ質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)研究。

３討論

目前，對(duì)于木本植物不同種、不同部位ＲＮＡ的提取，研究人員已經(jīng)總結(jié)出許多科學(xué)高效的方法［１０－１３］，但是在實(shí)際操作過(guò)程中，即使相同種屬的不同個(gè)體，用一套固定的提取方法也不能保證取得同樣的效果。梨極矮化突變體與蘋(píng)果梨相比，葉片厚且葉色更為濃綠，含有更多的糖類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，將研磨后的樣品加入到提取緩沖液中時(shí)，高含量的糖類(lèi)物質(zhì)使樣品黏稠結(jié)塊，不能充分與緩沖液接觸。而且，在相同的研磨條件下，梨極矮化突變體比蘋(píng)果梨更容易發(fā)生褐變，影響了ＲＮＡ的提取效果。本實(shí)驗(yàn)的ＣＴＡＢ法減少了樣品用量，以起到充分裂解樣品的作用；提高了β－巰基乙醇的用量，β－巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵使之失活［８］，從而抑制氧化反應(yīng)，避免褐化；分別采用１０ ｍｏｌ／Ｌ ＬｉＣｌ和５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ兩次沉淀去除多糖，效果十分明顯。ＣＴＡＢ法提取蘋(píng)果梨和梨極矮化突變體總ＲＮＡ質(zhì)量雖然均較好，但在提取穩(wěn)定性方面，前者明顯強(qiáng)于后者，說(shuō)明此法用于提取高酚高糖植物提取ＲＮＡ，仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

試劑盒法提取的ＲＮＡ，存在降解和雜質(zhì)污染現(xiàn)象，不利于ＲＮＡ的后續(xù)利用；ＳＤＳ法和改良ＣＴＡＢ法相比，雖然避免了高溫可能帶來(lái)的ＲＮＡ降解的風(fēng)險(xiǎn)，而且用時(shí)短，步驟簡(jiǎn)單，但是提取的ＲＮＡ存在雜質(zhì)污染。兩種方法提取的蘋(píng)果梨ＲＮＡ質(zhì)量均高于梨極矮化突變體，說(shuō)明這兩種方法對(duì)高酚高糖植物ＲＮＡ的提取效果不明顯。王壯偉等［９］應(yīng)用ＳＤＳ／酚法從蘋(píng)果屬組培苗中得到了高質(zhì)量、完整性好的總ＲＮＡ，但筆者應(yīng)用該方法并未得到質(zhì)量合格的梨極矮化突變體ＲＮＡ，可能與不同種屬植物的生理特性有關(guān)。另外，組培苗的離體生長(zhǎng)環(huán)境決定了其體內(nèi)的生長(zhǎng)代謝不同于大田植物，這可能是造成ＳＤＳ法在本實(shí)驗(yàn)中不能取得良好效果的另一原因。因此，在參考已報(bào)道的ＲＮＡ提取方法的前提下根據(jù)材料的特性做適當(dāng)?shù)母牧迹艜?huì)獲得預(yù)期的總RNA提取效果。

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