對(duì)甲基苯甲酸連接的氯霉素全抗原合成與鑒定

羅舜菁，陳婷婷，劉成梅，*，鄒常春，嚴(yán)杰琳，陳 臣，高 鵬

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047; 2.南昌大學(xué)，江西南昌330031)

對(duì)甲基苯甲酸連接的氯霉素全抗原合成與鑒定

羅舜菁1，陳婷婷1，劉成梅1，*，鄒常春2，嚴(yán)杰琳1，陳 臣1，高 鵬1

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047; 2.南昌大學(xué)，江西南昌330031)

以對(duì)氯甲基苯甲酸(CBA)或?qū)β燃谆郊姿峒柞?MCB)分別與氯霉素(CAP)反應(yīng)合成氯霉素-對(duì)甲基苯甲酸半抗原(CAP-MBAⅠ、CAP-MBAⅡ)，再與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備全抗原;通過(guò)紫外、熒光光譜掃描定性鑒定合成成功;bradford法結(jié)合TNBS法定量計(jì)算出全抗原表面半抗原密度(HD)。再將CAP-MBAⅡ與卵清蛋白(OVA)合成包被抗原(CAP-MBAⅡ-OVA)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA計(jì)算其抑制率。研究結(jié)果表明，半抗原全抗原偶聯(lián)效率優(yōu)于CAPMBAⅠ，MCB與CAP反應(yīng)合成的半抗原CAP-MBAⅡ更適合蛋白偶聯(lián)。采用CAP-MBAⅡ-OVA作為包被抗原可以提高ELISA檢測(cè)的抑制率從而增加其靈敏度。

氯霉素，對(duì)甲基苯甲酸，連接臂，全抗原

圖1 氯霉素及其體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物氯霉素糖醛酸的分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素 BBI公司;對(duì)氯甲基苯甲酸、對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯 強(qiáng)中化工;琥珀氯霉素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、三硝基苯磺酸 sigma公司;bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所;其余試劑 均為分析純。

DU 640可見-紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Beckman Coulter公司;F-4500型熒光光度計(jì) 日本日立公司;Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó) Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 半抗原氯霉素-對(duì)甲基苯甲酸(CAP-MBA)的合成

1.2.1.1 對(duì)氯甲基苯甲酸與氯霉素的反應(yīng) 稱取66mg CAP溶于4mL DMF與1，4-二氧六環(huán)的混合溶液中(1∶1，V/V)，加入34mg對(duì)氯甲基苯甲酸，40℃攪拌反應(yīng)8h，采用硅膠薄層層析(TLC)監(jiān)測(cè)合成反應(yīng)進(jìn)行。產(chǎn)物記作CAP-MBAⅠ，真空干燥備用。

1.2.1.2 對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯與氯霉素的反應(yīng) 稱取66mg CAP溶于4mL DMF與1，4-二氧六環(huán)體積比為1∶1的混合溶液中，加入44mg對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯，80℃加熱攪拌4h后，加入6mol/L的NaOH溶液0.2mL去甲酯化，室溫反應(yīng)3h后，離心后取上清液，加入6mol/L的 HCl溶液調(diào)節(jié) pH至7，反應(yīng)10min，采用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行。產(chǎn)物記作 CAPMBAⅡ，真空干燥備用。

1.2.2 全抗原合成

1.2.2.1 免疫抗原的合成 稱取120mg的 BSA溶于12mL DMF、0.01mol/L PBS、超純水(1∶1∶2，V/V)混合溶液中，得到10mg/mL BSA溶液，置于0℃平衡，此為A液;取1mL 0.5mol/L CAP-HS、CAP-MBAⅠ，CAP-MBAⅡ，分別加入10μL三正丁胺，冰浴條件下攪拌反應(yīng)10min，加入7μL氯甲酸異丁酯，室溫下攪拌反應(yīng)1h，作為活化半抗原，記為B液;按CAP與BSA起始摩爾比為40∶1、30∶1、20∶1、10∶1取適量A液放入不同錐形瓶中，將1mL B液逐滴加入到對(duì)應(yīng)的A液中，反應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，維持pH 8.5，攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)液裝入透析袋中，4℃用pH7.4 PBS透析3d，每天換液3次。透析后部分用于檢測(cè)及免疫，其余真空冷凍干燥備用。

1.2.2.2 包被抗原的合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果［13］，按半抗原與OVA起始摩爾比7∶1合成包被抗原CAP-HS-OVA、CAP-MBAⅡ-OVA。具體如下:將一定量CAP-HS和CAP-MBAⅡ溶于0.01mol/L PBS溶液中，分別加入一定量的EDC-HCl和NHS，控制pH在5.0左右，室溫避光振蕩活化15min。加入的一定量β-巰基乙醇淬滅未反應(yīng)的EDC-HCl。分別加入2mL 10mg/mL OVA溶液，室溫反應(yīng)2h后，反應(yīng)液中加入10mmol/L鹽酸羥胺，淬滅未反應(yīng)的NHS。反應(yīng)液用pH7.4的0.01mol/L PBS透析3d，透析后部分用于檢測(cè)，其余冷凍干燥備用。

1.2.3 全抗原的抗原的鑒定

1.2.3.1 紫外光譜掃描 將半抗原CAP-HS、CAPMBAⅠ、CAP-MBAⅡ，載體蛋白 BSA及全抗原CAP-HS-BSA、CAP-MBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA稀釋至合適濃度，在200～400nm處掃描紫外吸收光譜。

1.2.3.2 熒光光譜掃描 設(shè)置激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度為5nm，掃描速度為2400nm/min，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，在300～450nm之間掃描BSA及全抗原的發(fā)射光譜。

1.2.3.3 全抗原蛋白質(zhì)濃度及其表面半抗原密度計(jì)算 Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒繪制BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定CAP-HS-BSA，CAP-MBAⅠ-BSA，CAP-MBAⅡ-BSA的蛋白質(zhì)濃度，記作C(bradford);采用TNBS法繪制相應(yīng)的BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)測(cè)定三種全抗原的濃度，記作C(TNBS)。根據(jù)bradford法及TNBS法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度算得全抗原氨基替換率，按每個(gè)BSA分子上含有60個(gè)自由氨基計(jì)算出每個(gè)BSA分子上的半抗原密度(hapten density，HD)［14］。

按每個(gè)OVA分子上含40個(gè)自由氨基計(jì)，同法算得包被抗原的半抗原密度。

表1 全抗原的蛋白濃度及表面半抗原密度

1.2.4 不同包被抗原對(duì)抗體親和力的影響 CAPHS-OVA，CAP-MBAⅡ-OVA合成后，用間接ELISA檢測(cè)2種包被抗原與抗體的親和力。本實(shí)驗(yàn)所用抗體為CAP-HS-BSA免疫小鼠制得的抗氯霉素單克隆抗體。具體如下:CAP-HS-OVA，CAP-MBAⅡ-OVA稀釋至5μg/mL包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃靜置過(guò)夜后用1%PBST洗滌;加入380μL 3%脫脂牛奶封閉酶標(biāo)板，37℃溫育1h后洗滌;加入100μL梯度稀釋的抗體，抗體稀釋度為1∶800至1∶51200倍比稀釋，37℃溫育1h后洗滌;加入100μL酶標(biāo)羊抗小鼠IgG，37℃溫育1h后洗滌;加入100μL TMB顯色液，37℃溫育15min;加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液終止顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在450nm處吸光值為陽(yáng)性值。抗體滴度OD值為1.0時(shí)的抗體稀釋度。

1.2.5 不同包被抗原對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的影響采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)不同包被抗原對(duì)ELISA靈敏度的影響。將1.2.4加梯度稀釋抗體一步改為加入50μL濃度為0、4、10、20、40、100、140、200ng/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品及50μL最佳工作濃度的氯霉素單抗，其余步驟同上。計(jì)算抑制率(Inhibition Rate)，IR= (1-B/B0)×100%，B為加入競(jìng)爭(zhēng)品孔的吸光值，B0為競(jìng)爭(zhēng)品濃度為0的孔的吸光值。半數(shù)抑制率IC50為抑制率達(dá)到50%時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)品濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜

通過(guò)紫外掃描可知，CAP-MBA、CAP-HS、BSA的最大吸收峰分別在275、276、278nm處(如圖2所示)。與BSA相比，全抗原CAP-HS-BSA、CAPMBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA的最大吸收峰發(fā)生輕微藍(lán)移至277nm，峰形也略有不同。如圖2b、2c所示，隨著半抗原投料量的增加，全抗原的最大吸收峰值逐漸增大?？沙醪脚袛喟肟乖c載體蛋白偶聯(lián)成功。

2.2 熒光光譜

如圖3所示，隨著半抗原投料量的增加，CAPHS-BSA、CAP-MBAⅠ-BSA、CAP-MBAⅡ-BSA的熒光強(qiáng)度逐漸下降，最大發(fā)射波長(zhǎng)逐漸藍(lán)移。此現(xiàn)象與紫外檢測(cè)結(jié)果可共同判斷全抗原偶聯(lián)成功。singh等對(duì)莠去津全抗原的熒光發(fā)射光譜研究也得到相似的結(jié)果［15］。這是由于在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm處，蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光主要由酪氨酸殘基和色氨酸殘基產(chǎn)生。隨著投料量的增加，蛋白質(zhì)表面半抗原密度的增加，使得酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍環(huán)境疏水性增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移。

2.3 免疫抗原蛋白質(zhì)濃度及其表面半抗原密度計(jì)算

圖2 BSA、不同半抗原及不同起始摩爾比的各種全抗原的紫外吸收光譜

圖3 270nm處BSA及不同起始摩爾比的全抗原的熒光激發(fā)光譜

半抗原密度是全抗原免疫原性的重要影響因素，也對(duì)包被抗原的靈敏度有著重要影響。Bradford法是染料與蛋白上的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結(jié)合，使染料的最大吸收峰465nm移至595nm進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于同種蛋白測(cè)量準(zhǔn)確，靈敏度高。TNBS法則是測(cè)量蛋白質(zhì)上的自由氨基。先由Bradford法測(cè)得蛋白質(zhì)濃度，與TNBS測(cè)得濃度對(duì)比即可算出全抗原上的氨基替換率，從而計(jì)算半抗原密度。

以bradford法測(cè)定BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，y=2.7709x+1.0779，R2=0.9961，以TNBS法測(cè)定 BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.0081x+0.0023，R2=0.9987。

以bradford法測(cè)定OVA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程方程，y=2.6980x+0.9539，R2=0.9899，以TNBS法測(cè)定 OVA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.0043x+ 0.0159，R2=0.9964。包被抗原CAP-HS-OVA，CAP -MBAⅡ-OVA的蛋白濃度分別為6.28、6.34mg/mL，表面半抗原密度分別為3.3、3.1。

2.4 不同包被抗原對(duì)ELISA檢測(cè)的影響

在450nm處測(cè)得間接ELISA的吸光值反映了不同包被抗原對(duì)抗體的親和力，包被抗原的表面半抗原密度及包被濃度相同，其余ELISA條件一致的情況下，吸光值越高表示抗體對(duì)包被抗原的結(jié)合力越好，親和力越高。圖4為間接ELISA中不同包被抗原對(duì)應(yīng)的抗體稀釋曲線。相同抗體稀釋度下，CAPHS-OVA的吸光值高于CAP-MBAⅡ-OVA，由圖計(jì)算二者的抗體滴度分別為19314.3和8139.6。CAPMBAⅡ-OVA的半抗原與免疫半抗原具有不同的連接臂，降低了抗體對(duì)連接臂部分的識(shí)別，因此其對(duì)抗體的親和力小于CAP-HS-OVA［16］。

圖4 兩種包被抗原的抗體稀釋曲線

降低ELISA檢測(cè)的靈敏度是ELISA方法建立的主要目的。圖5所示為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抑制曲線，達(dá)到相同抑制率是，CAP-MBAⅡ-OVA做包被抗原的競(jìng)爭(zhēng)品濃度低于CAP-HS-OVA。半數(shù)抑制率IC50為判斷ELISA靈敏度的重要參數(shù)，包被CAPMBAⅡ-OVA和CAP-HS-OVA的ELISA檢測(cè)的IC50分別為 18.25ng/mL和 23.97ng/mL。由于 CAPMBAⅡ-OVA與抗體結(jié)合力下降，使得氯霉素與抗體作用機(jī)會(huì)增加，提高對(duì)ELISA檢測(cè)的抑制率，因此采用CAP-MBAⅡ-OVA做包被抗原提高了ELISA檢測(cè)的靈敏度［17］。

圖5 兩種包被抗原的競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制曲線

3 結(jié)論

半抗原設(shè)計(jì)通常包括了大量復(fù)雜的化學(xué)合成，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)簡(jiǎn)單的化學(xué)合成使CAP分子接上連接臂，制得新的半抗原CAP-MBA，半抗原合成反應(yīng)后，未反應(yīng)的對(duì)氯甲基苯甲酸遇水析出，可以很方便地除去;而未反應(yīng)的氯霉素分子不具有羧基，不參與與載體蛋白的偶聯(lián)反應(yīng)，可在全抗原合成反應(yīng)后通過(guò)透析除去。因此本實(shí)驗(yàn)在半抗原合成后，不需要采用紅外、質(zhì)譜等精確手段鑒定半抗原CAP-MBA，可直接將其用于全抗原合成。全抗原的表面半抗原密度與反應(yīng)溶液中合成成功的半抗原的含量成正比，因此通過(guò)計(jì)算全抗原的HD可半定量比較出不同方法合成的半抗原成功率。CAP-MBAⅡ-BSA表面半抗原密度(按起始摩爾比不同分別為15.0、6.6、3.3、1.7)略低于CAP-HS-BSA(17.4、11.2、4.7、3.7)，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CAP-MBAⅠ-BSA(6.4、2.6、2.3、0.2)。因此，通過(guò)將實(shí)驗(yàn)合成的CAP-MBA半抗原與商品化的CAP-HS比較可以得出，以對(duì)氯甲基苯甲酸合成的CAP-MBAⅠ合成效果稍差，以對(duì)氯甲基苯甲酸甲酯合成的CAP-MBAⅡ成功率較高，可用于全抗原合成。

在ELISA檢測(cè)中，通過(guò)對(duì)半抗原連接位點(diǎn)，連接臂長(zhǎng)度，結(jié)構(gòu)等進(jìn)行合理選擇與搭配，可以有效地利用可預(yù)測(cè)的交叉反應(yīng)，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)某一族化合物的目的，并且可以抑制不可預(yù)測(cè)的交叉反應(yīng)，提高檢測(cè)的特異性［18］。本實(shí)驗(yàn)合成半抗原CAP-MBA與琥珀氯霉素相比，連接臂連接位點(diǎn)相同，結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度不同，是理想的驗(yàn)證不同連接臂對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的半抗原。使用CAP-HS-BSA免疫小鼠獲得的抗體比較包被抗原CAP-HS-OVA與CAP-MBAⅡ-OVA對(duì)ELISA檢測(cè)的影響。以CAP-MBAⅡ-OVA為包被抗原親和力較弱(抗體滴度為8139.6低于CAP-HS-OVA的19314.3)，但能提高ELISA檢測(cè)的靈敏度(IC5018.25ng/mL低于 CAP-HS-OVA的23.97ng/mL)。這是由于通過(guò)選用含不同連接臂的包被抗原，可以消除識(shí)別連接臂部分抗體的干擾，從而降低抗體與包被抗原間的非特異性結(jié)合，使得競(jìng)爭(zhēng)品對(duì)抗體與包被抗原結(jié)合的抑制率增加，達(dá)到提高ELISA靈敏度的效果，與Kim等［8］報(bào)道一致。

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Synthesis and characterization of chloramphenicol complete antigen linked by 4-methylbenzoic acid

LUO Shun-jing1，CHEN Ting-ting1，LIU Cheng-mei1，*，ZOU Chang-chun2，YAN Jie-lin1，CHEN Chen1，GAO Peng1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China; 2.Nanchang University，Nanchang 330031，China)

A new Chloramphenicol(CAP)hapten was prepared by conjugate CAP with 4-(Chloromethyl)benzoic acid(CBA)or Methyl 4-(chloromethyl)benzoate(MCB).Two types of hapten(CAP-MBAⅠ，CAP-MBAⅡ)were used to synthesis complete antigen(CA)with BSA.CA was identified by UV and florescence spectrum.The hapten density of CA was evaluated by Bradford method together with TNBS method.CAP-MBAⅡwas then linked to OVA forming Solid-coating antigen(CAP-MBAⅡ-OVA).The results showed that MCB conjugated with CAP was better than CBA.CAP-MBAⅡ-OVA can rise the inhibit rate of ELISA and sensitivity can be improved.

chloramphenicol;4-methylbenzoic acid;linking arm;complete antigen

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0200-05

氯霉素(chorampheulcol，CAP)及其體內(nèi)代謝物氯霉素糖醛酸殘留具有血液系統(tǒng)毒性，可導(dǎo)致不可逆的再生障礙性貧血，嚴(yán)重危害人類健康［1］。因此，美國(guó)、歐盟等諸多國(guó)家規(guī)定禁止氯霉素用于食源性動(dòng)物，并將氯霉素列為必檢項(xiàng)目，規(guī)定不得檢出［2-3］。近年來(lái)，熒光偏振免疫分析［4］、基于表面等離子共振的生物傳感器［5］等新興免疫技術(shù)越來(lái)越多地運(yùn)用到動(dòng)物性食品的氯霉素檢測(cè)領(lǐng)域，酶聯(lián)免疫分析(ELISA)［6］、免疫層析［7］等傳統(tǒng)免疫檢測(cè)手段也在不斷改進(jìn)。氯霉素全抗原的研究作為免疫分析的核心對(duì)于提高氯霉素檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確性，提高食品中氯霉素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)速度及準(zhǔn)確度有重要的意義。異源性ELISA檢測(cè)中免疫半抗原與包被半抗原的差異性越大，抗體對(duì)包被抗原的識(shí)別減弱，使得待測(cè)物能與抗體結(jié)合作用機(jī)會(huì)增加，與包被抗原充分競(jìng)爭(zhēng)，從而能檢測(cè)較低濃度的待測(cè)物，從而提高ELISA檢測(cè)的靈敏度［8-9］。因此，本研究擬采用一種新的連接臂對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的影響。在氯霉素全抗原的制備中一般采用的偶聯(lián)方法有混合酸酐法［10］、重氮化法、碳化二亞胺法［11］和羰基二咪唑法［12］等。本實(shí)驗(yàn)擬采用對(duì)氯甲基苯甲酸［4-(Chloromethyl)benzoic acid，CBA］或?qū)β燃谆郊姿峒柞ィ跰ethyl 4-(chloromethyl)benzoate，MCB］與氯霉素合成氯霉素-對(duì)甲基苯甲酸(CAP-MBA)半抗原，選用BSA做載體蛋白，初步探索對(duì)氯甲基苯甲酸(CBA)作為連接臂合成氯霉素全抗原的方法及條件。再按照優(yōu)化的方法合成包被抗原，比較氯霉素-對(duì)甲基苯甲酸(CAP-MBA)半抗原與氯霉素琥珀酸酐(CAP-HS)半抗原對(duì)ELISA檢測(cè)靈敏度的影響。

2010-11-10 *通訊聯(lián)系人

羅舜菁(1969-)，女，副教授，碩士，研究方向:食品安全。

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ09062)。