新霉素的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法

徐乃豐，胥傳來(lái)，匡 華，屈昌龍，許 陽(yáng)，彭池方*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

新霉素的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法

徐乃豐，胥傳來(lái)，匡 華，屈昌龍，許 陽(yáng)，彭池方*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

首先用碳二亞胺(EDC)法將新霉素(NEO)偶聯(lián)于載體蛋白-卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)，合成包被原OVANEO，SDS-PAGE 進(jìn)行鑒定；用高碘酸鈉法連接辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，制備酶標(biāo)抗原NEO-HRP并建立直接ELISA檢測(cè)方法。通過(guò)一系列參數(shù)的優(yōu)化，包括包被溶液、封閉溶液、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、抗體稀釋液、pH值、反應(yīng)溫度、顯色時(shí)間等，最終得到其IC20(抑制率為20%時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度)＜1ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為7.6ng/mL，線(xiàn)性方程為y =－0.2798x＋0.7456，R2=0.991。直接ELISA總耗時(shí)只需大約1h。

新霉素；間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

動(dòng)物性食品的安全問(wèn)題已成為社會(huì)各界極為關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問(wèn)題。新霉素殘留因?yàn)槠錆撛诘闹掳┬砸约捌渌涣甲饔脤?duì)人類(lèi)的健康造成極大的威脅。作為一種重要的獸用抗生素，新霉素在奶牛等家畜的疾病治療中有較為廣泛的應(yīng)用[1-6]。但是，由于使用不規(guī)范等原因、常常導(dǎo)致新霉素在動(dòng)物性食品中過(guò)量殘留。新霉素藥物殘留對(duì)人體健康產(chǎn)生有害的影響，主要表現(xiàn)為耐藥性增加及腸道菌的紊亂、產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)及中毒、干擾激素平衡及癌變、急性中毒、污染環(huán)境及生態(tài)毒性[7-10]。因此，許多國(guó)家和地區(qū)都對(duì)新霉素制訂了最高殘留限量[11-13]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究新霉素殘留的間接和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法以及實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制以及樣品回收率的研究，以期為食品安全監(jiān)督以及技術(shù)儲(chǔ)備提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清蛋白(bovine serum albumin)、卵清白蛋白(ovalbumin)、考馬斯亮藍(lán)G250 上海伯奧生物科技公司；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase) 北京拜爾迪生物公司；硫酸新霉素(NEO) 美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(HRP-IgG) 康成生物工程公司；NEO抗體 自制；新霉素標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

AB104-N型電子分析天平 上海Metller Toledo公司；UV-2802PCS紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；101-A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 通州市扈通制藥機(jī)械設(shè)備廠(chǎng)；81-2型恒溫磁力加熱攪拌器 江陰市周莊電器五金廠(chǎng)；KFLO純水機(jī) 廈門(mén)凱佛隆公司；Costar96孔8×12可拆酶標(biāo)板 上海吉泰生物科技有限公司；Anke TGL-16C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；ZD-9556水平搖床 太倉(cāng)科教器材廠(chǎng)；MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀 芬蘭Thermo Labsystems公司；凝膠電泳儀 美國(guó)Thermo公司；XevoTM QTof質(zhì)譜儀、沃特世MassLynx 質(zhì)譜軟件 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 包被原的合成

稱(chēng)取20mg新霉素和20mg卵清白蛋白溶于PBS溶液(0.01mol/L，pH7.4)攪拌均勻(20min)，稱(chēng)70mg EDC加入到上述混合液中，攪拌反應(yīng)4h，然后進(jìn)行透析(20℃條件下用0.01mol/L PBS透析3d，12h換一次透析液)，透析結(jié)束之后，4℃條件保存。

1.3.2 酶標(biāo)記抗原的合成

1.3.2.1 HRP酶的活力測(cè)定

用碳酸鹽緩沖溶液(pH9.2)配制HRP 0.01μ mol/L酶溶液，再稀釋10倍，取10μL HRP溶液與100μL TMB底物反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為30s和1、1.5、2、2.5、3min，用100μL 2mol/L硫酸中止，測(cè)吸光度(A)。

1.3.2.2 HRP酶的活化

在試管中加入臨時(shí)配制的0.1mol/L碳酸鹽緩沖液0.5mL，與10mg HRP酶混合；加12mmol/L NaIO4液0.5mL，蓋上試管蓋，20℃避光反應(yīng)2h。

1.3.2.3 偶聯(lián)

15mg NEO溶于2mL 0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.2)；室溫反應(yīng)3h；加臨時(shí)配制的NaBH4(用0.1mmol/L NaOH配制成5mg/mL)300μL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h；透析2d，每天換液兩次；用1:1比例的甘油避光保存在－20℃的冰箱中；將偶聯(lián)的酶標(biāo)抗原(Ag-E)和HRP酶分別做質(zhì)譜圖和高效液相色譜圖。

1.3.3 工作濃度的確定

抗體包被：用包被緩沖液(pH9.6)將酶標(biāo)抗原(Ag-E)系列稀釋至250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000倍，在每孔中加100μL，37℃孵育2h。之后取出微孔板倒空孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。

封被：每孔加200mL封閉液，于37℃孵育2h，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。

抗原抗體反應(yīng)：用抗體緩沖液將抗體(Ab)稀釋成不同的倍數(shù)(250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000)，每孔加入100μL，置于37℃ 30min。倒空液體，用洗劑緩沖液洗3次，每次3min。

加底物顯色：于各孔中加入臨時(shí)配制的顯色液(TMB:底物緩沖液=1:5，V/V)100μL，反應(yīng)15min，于各孔中加入2mol/L硫酸100μL終止反應(yīng)。

測(cè)定A450nm選取最適工作濃度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)選取酶標(biāo)抗原/抗體(Ag-E/Ab)最適工作濃度為64000/1000和128000/1000；將以最佳稀釋度1000的抗體包被96孔酶標(biāo)板100μL/孔，37℃孵育2h；取出酶標(biāo)板，回至室溫(24℃左右)，每孔加200μL、pH7.4、體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20的PBST洗液，搖床振蕩3min，用力甩掉洗液，在吸水紙上拍干，再重復(fù)洗滌2次；添加封閉液200μL/孔，37℃孵育2h；取出酶標(biāo)板，按步驟2洗滌，再放入37℃溫育箱內(nèi)烘干15min；取出酶標(biāo)板，第一排加50μL/孔的PBS(0.01mol/L)溶液，從第二排起分別加7個(gè)質(zhì)量濃度(1、2.5、5、10、25、50、100ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(用0.01mol/L PBS稀釋)50μL/孔，兩個(gè)重復(fù)；再加入以最佳稀釋度的酶標(biāo)抗原64000、128000倍(用抗體稀釋液稀釋)50μL/孔，37℃/30min。取出洗3遍，拍干；每孔加入100μL顯色液(TMB與底物緩沖液比例1:5)，37℃烘箱反應(yīng)15min，取出每孔加入100μL終止液(2mol/L硫酸)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度(A450nm)；求出各濃度的B/B0值，B0為標(biāo)準(zhǔn)溶液為0ng/mL時(shí)的吸光度。以B/B0為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，即得NEO的競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 新霉素直接ELISA檢測(cè)方法酶標(biāo)記抗原的合成

2.1.1 HRP酶的活力測(cè)定

圖1 偶聯(lián)前后酶活力的比較Fig.1 Comparison of enzyme activity before and after coupling

一個(gè)酶活性單位定義為每分鐘在403nm波長(zhǎng)處吸光度的變化為1所需酶的量，酶的比活性為毫克酶蛋白的活性(U/mg)[14-15]。由圖1可以看出，HRP酶在不同反應(yīng)時(shí)間中測(cè)定吸光度(403nm)，標(biāo)記前后酶活性明顯降低，計(jì)算得降低到22.1%。

2.1.2 高效液相色譜與質(zhì)譜圖

圖2 NEO-HRP高效液相色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 HPLC-MS chromatograph of NEO-HRP

圖3 NEO-HRP峰4.369min的質(zhì)譜棒狀圖Fig.3 Mass spectrogram of NEO-HRP at 4.369 min

圖4 HRP高效液相色譜-紫外檢測(cè)圖Fig.4 HPLC-UV detection of HRP

圖5 HRP峰3.842min質(zhì)譜棒狀圖Fig.5 Mass spectrogram of HRP at 3.842 min

圖6 HRP的相對(duì)分子質(zhì)量(峰3.842 min)Fig.6 Molecular weight of HRP (peak at 3.842 min)

由圖5和圖6可知，通過(guò)Waters MassLynx 質(zhì)譜軟件，根據(jù)質(zhì)荷比計(jì)算得到HRP(峰3.842min)的相對(duì)分子質(zhì)量為43136.0。

圖7 HRP峰4.063min質(zhì)譜棒狀圖Fig.7 Mass spectrogram of HRP at 4.063 min

圖8 HRP的相對(duì)分子質(zhì)量(峰4.063min)Fig.8 Molecular weight of HRP (peak at 4.063 min)

由圖7和圖8可知，通過(guò)沃特世 MassLynx 質(zhì)譜軟件，根據(jù)質(zhì)荷比計(jì)算得到HRP(峰4.063min)的相對(duì)分子質(zhì)量為41940.0。

圖9 HRP峰5.219min質(zhì)譜棒狀圖Fig.9 Mass spectrogram of HRP at 5.219 min

綜上，由圖2～9可以看出，結(jié)果得到了并非單一酶的HRP-NEO偶聯(lián)物。

2.2 工作濃度的確定

將純化后的新霉素抗體系列稀釋250、500、1000、2000、4000、8000、16000、32000倍，將酶標(biāo)抗原稀釋1000、4000、16000、64000、128000倍。用方陣滴定法確定酶標(biāo)抗原和抗體的工作濃度，布板方式見(jiàn)表1。

表1 方陣滴定法確定工作濃度Table 1 Determination of working concentration with blocking titration

測(cè)工作點(diǎn)以這樣的方式布板的好處是可以找出那些符合吸光度的點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)適當(dāng)大的稀釋度能增加方法的靈敏度，而且適當(dāng)大的抗體稀釋度能夠降低抗血清中干擾物質(zhì)的干擾。因?yàn)榭寡褰?jīng)過(guò)純化，濃度稀釋了很多倍，因此工作濃度的稀釋倍數(shù)比純血清的工作濃度的稀釋倍數(shù)小得多由表1可見(jiàn)，在酶標(biāo)抗原稀釋度為64000和128000，抗體稀釋倍數(shù)為1000時(shí)，吸光度為1.512和1.355時(shí)，可以確定為較佳的稀釋度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以B/B0為縱坐標(biāo)，以新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)作圖，得到新霉素的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=－0.2525x＋0.6673，R2=0.983，計(jì)算得半數(shù)抑制量(IC50)為4.7ng/mL，線(xiàn)性范圍為1.0～100.0ng/mL。作為用以定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以達(dá)到檢測(cè)的要求。

2.4 直接ELISA方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)下列參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)完全按照優(yōu)化的順序進(jìn)行。每個(gè)參數(shù)的優(yōu)化都采用了之前優(yōu)化的參數(shù)作為實(shí)驗(yàn)條件。評(píng)判的依據(jù)很多，本研究采用IC50、Amax以及Amax/IC50來(lái)作為整個(gè)優(yōu)化過(guò)程的依據(jù)。IC50是個(gè)很重要的參數(shù)，很多文獻(xiàn)中都用此來(lái)作為判斷依據(jù)。

2.4.1 包被緩沖液的影響

表2 包被緩沖液的優(yōu)化Table 2 Optimization of coating buffer

本實(shí)驗(yàn)考察兩種常用包被液(碳酸鹽緩沖液、0.01mol/L PBS)對(duì)確定工作濃度的影響。從表2可知，在相同工作濃度下，A隨著包被液的不同只有輕微改變，因此，不同的包被緩沖液對(duì)于工作濃度的選擇影響很小。

表3 包被溶液的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 3 Optimization of coating antigen (Ab 1000/Ag 64000)

本實(shí)驗(yàn)考察兩種常用包被液(碳酸鹽緩沖液、0.01mol/L PBS)對(duì)抑制曲線(xiàn)的影響。從表3可見(jiàn)，Amax隨著碳酸鹽緩沖液，PBS溶液順序依次降低。兩種包被液對(duì)IC50的影響變化很大。以?xún)烧叩谋壤鼳max/IC50來(lái)看，碳酸鹽緩沖液的值遠(yuǎn)大于PBS。因此，碳酸鹽緩沖液為較理想的選擇。

2.4.2 封閉液的影響

表4 封閉液的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 4 Optimization of blocking solution (Ab 1000/Ag 64000)

本實(shí)驗(yàn)考察3種封閉液：0.1%明膠、1% OVA、1%酪氨酸對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的影響。從表4可見(jiàn)，Amax隨著酪氨酸、明膠、OVA順序依次降低。3種封閉液對(duì)IC50的影響變化很大。以?xún)烧叩谋壤鼳max/IC50來(lái)看，0.1%明膠作為封閉液的值遠(yuǎn)大于其余兩個(gè)。因此，0.1%明膠為較理想的選擇。

2.4.3 pH值的影響

表5 酶標(biāo)抗體稀釋液的pH值對(duì)ELISA的影響(Ab1000/Ag64000)Table 5 Effect of pH of labeled antibody diluent on ELISA (Ab 1000/Ag 64000)

從表5可以看到，pH值過(guò)低(pH4.0)或過(guò)高(pH10.0)均會(huì)導(dǎo)致抗體抑制能力的下降，甚至沒(méi)有抑制。pH6.0～8.0時(shí)，IC50抑制較好，故選pH7.4的酶標(biāo)抗原稀釋液為最佳pH值。

2.4.4 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的影響

表6 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 6 Optimization of competition time (Ab 1000/Ag 64000)

表6是抗體與新霉素在不同競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)所得到的結(jié)果。隨著時(shí)間的增加，Amax有所變化，IC50先隨著時(shí)間下降而后又上升。因此，選擇30min為最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間。

2.4.5 溫度的影響

表7 反應(yīng)溫度的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 7 Optimization of reaction temperature (Ab 1000/Ag 64000)

表7是反應(yīng)溫度分別為20℃和37℃的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果。其中，Amax的值隨溫度增加而升高。因此，在37℃時(shí)，吸光度較高，而且IC50也很理想，所以選擇37℃。

2.4.6 顯色時(shí)間的影響

表8 顯色時(shí)間的優(yōu)化(Ab1000/Ag64000)Table 8 Optimization of chromogenic time (Ab 1000/Ag 64000)

表8是顯色時(shí)間分別為5、15min和25min的ELISA結(jié)果。其中，Amax的值隨時(shí)間增加而增大，然而空白值也隨之增加，從0.07增加到0.85左右。因此，顯色時(shí)間不能再增加，否則，本底將會(huì)很高，不可取。在15min時(shí)，吸光度較高，而且IC50也很理想，所以選擇15min作為顯色時(shí)間。

當(dāng)所有相關(guān)條件確定后，采用包被緩沖液為pH9.6、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，包被時(shí)間為2h(37℃)，ELISA用的溶液系統(tǒng)為pH7.4，0.01mol/L的PBS溶液，競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為37℃孵育0.5h，顯色時(shí)間15min，封閉緩沖液為明膠，進(jìn)行ELISA的綜合實(shí)驗(yàn)，以B/B0為縱坐標(biāo)，以新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)作圖，得到新霉素的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)其IC20(抑制率為20%時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度)＜1ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為7.6ng/mL，線(xiàn)性方程為y=－0.2798x＋0.7456，R2=0.991。適合食品中新霉素的檢測(cè)應(yīng)用。

2.4.7 樣品回收率的測(cè)定

通過(guò)計(jì)算得牛奶樣品中的新霉素添加回收率，如表9所示。

表9 牛奶中的新霉素添加回收率Table 9 Recovery rate of spiked neomycin in milk

由表9可以看出，新霉素在牛奶中的添加值5.0ng/g和50ng/g，添加回收率分別為81.60%和89.88%，添加回收率隨添加量的增加而有所增加。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將新霉素半抗原與牛血清白蛋白和卵清白蛋白分別交聯(lián)制成免疫抗原和包被抗原，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并優(yōu)化了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法以及直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，主要結(jié)論如下：利用戊二醛法合成了NEO的免疫原NEO-BSA，用碳化二亞胺 (EDC)法包被抗原NEOOVA，高碘酸鈉法合成酶標(biāo)抗原NEO-HRP；建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)NEO。最終得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y＝－0.1405x＋1.3753，R2=0.977，半數(shù)抑制量(IC50)為9.6ng/mL，線(xiàn)性范圍為0.5～50.0ng/mL；建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。通過(guò)一系列參數(shù)的優(yōu)化，包括包被溶液、封閉溶液、抗體反應(yīng)時(shí)間、抗體稀釋液pH值、反應(yīng)溫度、顯色時(shí)間等，最終得到其IC20(抑制率為20%時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度)＜1ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為7.6ng/mL，線(xiàn)性范圍為1～100ng/mL，線(xiàn)性方程為y=－ 0.2798x＋0.7456，R2=0.991。

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Direct Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Neomycin

XU Nai-feng，XU Chuan-lai，KUANG Hua，QU Chang-long，XU Yang，PENG Chi-fang*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The neomycin (NEO) was coupled with ovalbumin (OVA) to form a coating antigen NEO-OVA by EDC method and determined by SDS-PAGE. The NEO was coupled with horseradish peroxidase (HRP) by NaIO4 method to establish enzymatic tracer NEO-HRP and direct competitive ELISA. Then, the parameters coating liquid, pH, incubation time and incubation temperature of direct ELISA were optimized. The IC20 value (20% inhibitory concentration) was less than 1 ng/mL and IC50 value (50% inhibitory concentration) was 7.6 ng/mL. The linear equation was y = －0.2798x ＋0.7456, R2= 0.991. The total consumption time of direct competitive ELISA was 1 h.

neomycin；indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay；direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay

S859.84

A

1002-6630(2011)10-0212-06

2010-07-16

徐乃豐(1984—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)闅埩粑餀z測(cè)。E-mail：xunaifeng217@163.com

*通信作者：彭池方(1975—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：pcf2125@yahoo.com.cn