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    高通量全自動(dòng)儀器法測(cè)定植物源性食品中甲基托布津殘留量

    2011-10-28 07:32:46李愛軍王明泰吳連鵬盧利軍胡婷婷趙冬晗姚天玲
    食品科學(xué) 2011年10期
    關(guān)鍵詞:托布津殘留量源性

    李愛軍,王明泰,吳連鵬,牟 峻,盧利軍,周 曉,胡婷婷,趙冬晗,姚天玲

    (1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,吉林 長春 130062;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林 長春 130118;3.長春大成玉米開發(fā)有限公司,吉林 長春 130062)

    高通量全自動(dòng)儀器法測(cè)定植物源性食品中甲基托布津殘留量

    李愛軍1,王明泰1,吳連鵬1,牟 峻1,盧利軍1,周 曉1,胡婷婷1,趙冬晗2,姚天玲3

    (1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,吉林 長春 130062;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林 長春 130118;3.長春大成玉米開發(fā)有限公司,吉林 長春 130062)

    建立高效的應(yīng)用高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀、全自動(dòng)凈化在線濃縮儀及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定植物源性食品中甲基托布津殘留量的檢測(cè)方法。試樣經(jīng)高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀,用乙腈均質(zhì)提取,經(jīng)全自動(dòng)凈化在線濃縮儀(凝膠色譜柱、固相萃取柱)凈化、在線濃縮后,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀定量定性分析,外標(biāo)法定量,液相流動(dòng)相為甲醇-水,采用電噴霧離子源,定性離子對(duì)為m/z 343.0>151.1、m/z 343.0>192.1,定量離子對(duì)為m/z 343.0>151,添加0.01~10.0mg/kg的甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的回收率為88.4%~97.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.3%~2.9%之間,最低檢出限為0.01mg/kg。該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、高通量、全自動(dòng)、快速高效,可應(yīng)用于植物源性食品的甲基托布津殘留量檢測(cè)。

    高通量全自動(dòng);植物源性食品;甲基托布津

    甲基托布津(thiophanate-methyl,化學(xué)名為1,2-二(3-甲氧碳基-2-硫脲基)苯,CAS號(hào)為 23564-05-8,結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種廣譜性內(nèi)吸低毒殺菌劑,純品為無色結(jié)晶,原粉(含量約93%)為微黃色結(jié)晶,比重1.5(20℃)、熔點(diǎn)172℃(分解)、蒸氣壓949.1×10-8Pa(25℃)。幾乎不溶于水,可溶于丙酮、甲醇、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑,對(duì)酸、堿穩(wěn)定。它最初由日本曹達(dá)株式會(huì)社研制開發(fā),對(duì)多種植物病害有預(yù)防和治病作用,其內(nèi)吸性比多菌靈強(qiáng)。甲基托布津按其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬取代苯類殺菌劑。

    關(guān)于植物源性食品中甲基托布津殘留量的檢測(cè)方法,目前有氣相色譜法[1-3]、紫外分光光度法[4]、氣相色譜法[5-6],這些方法存在過程冗長、試劑用量較大、靈敏度低、檢測(cè)品種單一、檢測(cè)低線不能滿足國內(nèi)外限量要求[7]、自動(dòng)化程度較低、無法定性確證等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在借鑒國際國內(nèi)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法[8-12]基礎(chǔ)上,建立具有特異性強(qiáng)、敏感性高、高通量、全自動(dòng)、快速高效等特點(diǎn),完全符合國內(nèi)、國際植物源性食品安全的甲基托布津殘留量檢測(cè)方法。

    圖1 甲基托布津分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Thiophanate-methyl molecule structure

    1 材料與方法

    1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

    除有特殊規(guī)定外,試劑均為分析純,水均為二次蒸餾水。乙腈、甲醇、甲苯(均為色譜純);氫氧化鈉溶液(1.0mol/L):稱取4.0g氫氧化鈉,用水溶解并定容至100mL;乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1,V/V);甲苯-乙腈(3:1,V/V);甲醇-水(1:1,V/V);標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取100mg(精確到0.1mg)的甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇-水(1:1,V/V)溶解并定容于100mL容量瓶中;配制成質(zhì)量濃度為1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)需要再用甲醇-水(1:1,V/V)稀釋成適用質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    1.2 儀器與設(shè)備

    API4000液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀[配有電噴霧(ESI)源] 美國A&B應(yīng)用生物技術(shù)有限公司;FASTH21高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀 北京測(cè)迪科技有限公司;PreLinc全自動(dòng)凈化色譜儀(配有凝膠凈化、固相萃取、在線濃縮系統(tǒng)) 北京綠綿巨貿(mào)有限公司;離心機(jī)(5000r/min);渦旋混勻器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;氮?dú)獯蹈蓛x;電子天平(感量0.001g);0.20μm有機(jī)濾膜。

    1.3 測(cè)定方法

    1.3.1 提取

    稱取5.0g(精確至0.01g)樣品于50mL塑料離心管中,加入5mL水,放入高通量全自動(dòng)均質(zhì)儀進(jìn)行自動(dòng)勻漿,再加入適量氫氧化鈉溶液,調(diào)試液的pH7~8,并加入2.0g氯化鈉,于渦旋混勻器上混勻。先用10mL乙腈提取一次,渦旋混合3min,以5000r/min離心2min。取上層清液于另一25mL離心管中,殘?jiān)偌尤?mL乙腈,重復(fù)提取一次,合并上清液。提取液在氮?dú)獯蹈蓛x上40℃條件下濃縮至近1mL。加入10mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1,V/V),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),近干,加入10mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1,V/V),待凈化。

    1.3.2 凝膠色譜(GPC)、固相萃取(SPE)凈化

    1.3.2.1 凝膠色譜條件

    凝膠凈化柱:Bio Beads S-X3[700mm×25mm(i.d.)];流動(dòng)相:乙酸乙酯-環(huán)己烷(1:1,V/V);流速:4.7mL/min;樣品定量環(huán):10mL;預(yù)淋洗時(shí)間:10min;凝膠色譜平衡時(shí)間:5min;收集時(shí)間:21~28min。

    1.3.2.2 凝膠色譜凈化步驟

    將10mL待凈化液按上述條件進(jìn)行凈化,收集組分于40℃在線濃縮至1mL,待固相萃取凈化。

    1.3.2.3 固相萃取(SPE)凈化

    將氨基活性碳復(fù)合固相萃取小柱連接到全自動(dòng)凈化色譜儀,設(shè)定凈化程序:用6mL甲苯-乙腈溶液預(yù)淋洗,加入1mL凝膠凈化濃縮液(1.3.2.2節(jié)),控制流速為1.5mL/min,并用20mL甲苯-乙腈溶液洗脫,待在線濃縮。

    1.3.2.4 在線濃縮

    收集所有流出液,在線濃縮并用甲醇-水溶液定溶至1.0mL,過0.20μm有機(jī)相微孔濾膜后,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

    1.4 色譜條件

    色譜柱:Aglient XDB C18[150mm×2.1mm(i.d.),3.5μm];流動(dòng)相:甲醇溶液;流速:0.5mL/min;進(jìn)樣量:1 0μL;柱溫:3 0℃。

    1.5 質(zhì)譜條件

    離子源:電噴霧(ESI)離子源,正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MR M)。其他參數(shù):電噴霧電壓(IS):5500V;離子源溫度(TEM):450℃;輔助氣1壓力(GS1):40psi;輔助氣2壓力(GS2):50psi;氣簾氣壓力(CUR):15psi;碰撞氣(CAD):7psi;入口電壓(EP)和出口電壓(CXP):10V;氣簾氣(CUR):10psi。檢測(cè)離子對(duì)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

    表1 甲基托布津的選擇離子對(duì)和優(yōu)化參數(shù)Table 1 Selected ion pairs and optimized parameters for the mass spectral analysis of thiophanate methyl

    1.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定

    1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    分別從質(zhì)量濃度為1000μg/mL的標(biāo)液中吸取0.1、0.5、2.5、4.0、5.0mL,用50mL空白基質(zhì)溶液定容,此時(shí)溶液中甲基托布津質(zhì)量濃度分別為0.20、1.00、5.00、8.00、10.00μg/mL。注入進(jìn)樣瓶中進(jìn)行色譜測(cè)定,按1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行分離,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸收峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以保留時(shí)間及離子對(duì)m/z 343.0>151.1、m/z 343.0>192.1進(jìn)行定性,離子對(duì)m/z 343.0>151.1為定量離子,外標(biāo)法定量。

    1.6.2 計(jì)算

    試樣中甲基托布津的含量/(mg/kg)按下式計(jì)算:

    式中:As為標(biāo)樣溶液中甲基托布津的峰面積;A為試樣溶液中甲基托布津的峰面積;Cs為所用甲基托布津標(biāo)樣溶液的質(zhì)量濃度/(μg/mL);V為樣品最終定容體積/mL;m為試樣的質(zhì)量/g。

    1.6.3 空白實(shí)驗(yàn)

    除不稱取樣品外,均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。

    1.7 定性測(cè)定

    圖2 甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)色譜圖Fig.2 LC/MS/MS chromatogram of thiophanate methyl standard in MRM mode

    利用串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定性分析,在上述條件下,甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間為4.66min,甲基托布津標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)色譜圖見圖2。

    在扣除背景后的樣品譜圖中,各定性離子與同樣條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖中對(duì)應(yīng)的離子相對(duì)豐度,應(yīng)不超過表2中的規(guī)定范圍。

    表2 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許相對(duì)偏差Table 2 Maximum allowable standard derivations of relative abundance of ion in qualitative confirmation %

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品種類的確定

    甲基托布津主要用于水果、蔬菜的殺菌劑,參與實(shí)驗(yàn)的果菜樣品有蘋果、柑橘、菠菜、黃瓜、白菜、大米、玉米。這7種樣品在植物源性食品中較常見。

    2.2 色譜條件優(yōu)化

    考察美國Agilent、Waters等不同公司、不同型號(hào)的色譜柱,最終選擇Aglient XDB C18[150mm×2.1mm(i.d.)×3.5μm],可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

    考察不同配比的甲醇-水作為流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)不同比例的流動(dòng)相對(duì)出峰時(shí)間并沒有太大影響,考慮到實(shí)際使用,最終確定甲醇:水=50:50(V/V)為最佳流動(dòng)相。

    2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    根據(jù)甲基托布津的分子結(jié)構(gòu)特征,選擇電噴霧(ESI)離子源,在正離子模式下對(duì)甲基托布津進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析,得到甲基托布津的分子離子峰,選擇合適的分子離子峰進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎片分析,得到特征子離子信息,根據(jù)其質(zhì)譜圖中的碎片離子選擇豐度相對(duì)較高和相對(duì)分子質(zhì)量較大的碎片,選擇合適的離子對(duì)進(jìn)行電噴霧電壓(IS)、離子源溫度(TEM)、碰撞氣(CAD)、入口電壓(EP)、出口電壓(CXP)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化,使甲基托布津的分子離子與特征碎片離子的靈敏度達(dá)到最大時(shí)定為最佳質(zhì)譜條件。優(yōu)化后定性離子對(duì)為m/z 343.0>151.1、343.0>192.1,定量離子對(duì)為m/z 343.0>151.1。

    2.4 線性范圍、最低檢出限、回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

    結(jié)果表明,在0.01~10.0μg/mL含量范圍內(nèi)各物質(zhì)的峰面積(Y)與含量(X)具有良好的線性關(guān)系?;貧w方程和線性相關(guān)系數(shù)(r)為Y=206851X+10478.6(r=0.9998)。

    對(duì)10個(gè)陰性的水樣進(jìn)行測(cè)定,得出響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)差,按最小檢出限為空白值3倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算,將峰面積換算成被測(cè)物濃度,甲基托布津的最小檢出限為0.01mg/kg。

    進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)時(shí),甲基托布津的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)采用樣品基質(zhì)溶液進(jìn)行溶解及配制。甲基托布津的標(biāo)準(zhǔn)添加量為0.10mg/kg,按上述的樣品處理和測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)試,方法回收率在88.4%~97.9%之間。

    取實(shí)驗(yàn)室制備的含有甲基托布津的飼料樣品,按處理方法進(jìn)行提取測(cè)定,連續(xù)測(cè)定6次,以實(shí)際測(cè)定濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表征方法的精密度。甲基托布津峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.3%~2.9%之間。

    2.5 LC-MS/MS確證分析

    本方法采用串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù),利用串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì),使用保留時(shí)間和兩對(duì)離子對(duì)進(jìn)行確證,滿足國際上對(duì)物質(zhì)確證的得分要求,在色譜圖中相應(yīng)的保留時(shí)間范圍內(nèi)未見干擾,可以根據(jù)峰面積,采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。定性離子對(duì)為m/z 343.0>151.1、343.0>192.1,定量離子對(duì)為m/z 343.0>151.1。

    2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

    采用本方法對(duì)近期(2010年3月—2010年11月)菜市場(chǎng)交易的植物源性食品樣品進(jìn)行檢測(cè),總計(jì)檢測(cè)了38批植物源性樣品,包括玉米、黃瓜、青椒西蘭花等品種,結(jié)果有2批樣品檢測(cè)出甲基托布津,甲基托布津殘留量分別為11.0、9.2mg/kg。

    [1] 日本甘薯中多菌靈、托布津、甲基托布津、苯菌靈(總量)的殘留限量規(guī)定[EB/OL]. (2006-10-19)[2010-04-15]. http://db.foodmate.net/pesticide/read_ncxl.php?pid=78883.

    [2] 湖南進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局. SN/T 0162—1992 出口水果中甲基托布津殘留量檢驗(yàn)方法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1992.

    [3] 聶洪勇, 黃志強(qiáng), 袁智能, 等. 氣相色譜法測(cè)定柑桔中甲基托布津殘留量[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 1989(2): 11-13.

    [4] 衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所. GB/T 5009.188—2003 蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測(cè)定[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

    [5] 廖國會(huì), 段婷婷, 秦立新, 等. 高效液相色譜同時(shí)測(cè)定蔬菜中多菌靈、甲基托布津殘留量[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 33(4): 26-28.

    [6] 林江麗, 張麗靜, 張旭龍, 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定甲基托布津和撲海因[J]. 分析化學(xué), 2001, 29(8): 933-935.

    [7] 葛志榮. 食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量[M]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006: 1282-1283.

    [8] 天津進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局. SN/T 0125—1992 出口肉及肉制品中敵百蟲殘留量檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1992.

    [9] 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局. SN/T 1920—2007 出口動(dòng)物源性食品中敵百蟲、敵敵畏、蠅毒磷殘留量的檢驗(yàn)方法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007.

    [10] 胡小鐘, 儲(chǔ)曉剛, 余建新, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法快速篩選測(cè)定濃縮蘋果汁中105種農(nóng)藥殘留量[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2003, 22(6): 26-28.

    [11] 葛志榮. 食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量[M]. 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006: 984-1229.

    [12] 湖北進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局. SN/T 0209—1993 出口糧谷中辛硫磷殘留量檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1993.

    High-throughput Automated Instrumental Analysis of Thiophanate-methyl Residue in Plant-derived Foods

    LI Ai-jun1,WANG Ming-tai1,WU Lian-peng1,MU Jun1,LU Li-jun1,ZHOU Xiao1,HU Ting-ting1,ZHAO Dong-han2,YAO Tian-ling3
    (1. Jilin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China;2. Jinlin Agricultural University, Changchun 130118, Chian;3. Changchun Dacheng Maize Development Company, Changchun 130062, China)

    An efficient detection method for thiophanate methyl residue in plant-derived foods was established by combing a high-throughput automated homogenizer, an automatic online purification and concentration system and a liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Samples were homogenized with acetonitrile on a high-throughput automated homogenizer,purified using an automatic online purification (gel chromatographic and solid phase extraction column) system, online concentrated and detected using a liquid chromatography-tandem mass spectrometer. The quantification of thiophanate methyl was carried out using the external standard method. The detection conditions were: acetonitrile-water (gradient) as mobile phase, ESI as ionization method, qualitative ion pairs of m/z 343.0>151.1 and 343.0>192.1, quantitative ion pairs of m/z 343.0>151.1.With the addition of 0.01 to 10.0 mg/kg of thiophanate standard to samples, the recovery rate was between 88.4% and 97.9% and the relative standard deviations (RSDs) varied from 1.3% to 2.9%. The detection limit of the established method was 0.01 mg/kg.

    high-throughput automated system;plant-derived foods;thiophanate-methyl residue

    TS207.53

    A

    1002-6630(2011)10-0133-04

    2010-07-14

    國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目(2009B160)

    李愛軍(1968—),男,研究員,碩士,主要從事食品分析、農(nóng)殘檢驗(yàn)研究。E-mail:liaj@jlciq.gov.cn

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