對硝基苯酚法對雅致放射毛霉脂肪酶特性的研究

李 蓓，李曉暉，衣杰榮

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

對硝基苯酚法對雅致放射毛霉脂肪酶特性的研究

李 蓓，李曉暉，衣杰榮*

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

以不同碳鏈長度的對硝基苯酚酯為底物對雅致放射毛霉(Actinomucor elegansAS 3.27)脂肪酶的酶學(xué)特性和其發(fā)酵的腐乳在發(fā)酵過程中脂肪酶活力的變化進行研究，結(jié)果表明:分別以對硝基苯酚正辛酸酯(pNPC)和對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)為反應(yīng)底物所測得的脂肪酶酶學(xué)特性有所不同。以pNPC和pNPP為反應(yīng)底物時，雅致放射毛霉脂肪酶的最適作用溫度分別為30、35℃，最適作用pH為7.5、7.0，最適鹽濃度都為0.20mol/L。以兩種底物分別測定雅致放射毛霉接種的腐乳在發(fā)酵過程中的脂肪酶活力，均顯示在后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢，然而在第20～25d脂肪酶活力呈現(xiàn)出小幅度的反復(fù)。使用堿滴定法以聚乙二醇－橄欖油為底物進行驗證，得到相同的趨勢。

對硝基苯酚法，對硝基苯基正辛酸酯，對硝基苯基棕櫚酸酯，脂肪酶，雅致放射毛霉

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans AS3.27)，異名匍匐放射毛霉，是我國目前腐乳釀造中最常用的一種菌種。在腐乳前期培菌的過程中，毛霉除了分泌大量的蛋白酶之外，同時還生成了大量的脂肪酶。這些脂肪酶在腐乳的后期發(fā)酵過程中對坯體的脂肪進行降解，產(chǎn)生游離脂肪酸，從而進一步酯化呈香，形成腐乳獨特的風(fēng)味［1］。長期以來，人們都習(xí)慣使用堿滴定法來測定各種微生物脂肪酶的活力，然而在國外，更多的是使用對硝基苯酚法來測定。但用對硝基苯酚法測定雅致放射毛霉脂肪酶活力的研究未見報道。本文結(jié)合腐乳的生產(chǎn)實際，運用對硝基苯酚法對雅致放射毛霉胞外脂肪酶的酶學(xué)特性以及后期發(fā)酵過程中毛霉脂肪酶活力進行研究，旨在探討對硝基苯酚法測定脂肪酶活力的可行性，以及采用親水親油性不同的作用底物時毛酶脂肪酶作用的特點，以期進一步探討乳狀液微觀體系對脂肪酶作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 用于雅致放射毛霉酶學(xué)特性研究的粗酶液AS 3.27培養(yǎng)條件∶接種在馬鈴薯培養(yǎng)液中，接種量為0.5%，160r/min搖床培養(yǎng)，48h。粗酶液直接以發(fā)酵原液進行測定。單位為μmol/(min·mL)(mL指發(fā)酵原液體積)。

1.1.2 用于腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力測定的粗酶液 加入2倍腐乳樣品質(zhì)量的0.15mol/L氯化鈉溶液，4000r/min下冷凍離心5min即為粗酶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿滴定法測定脂肪酶活力 參見江慧芳［2］堿滴定法測定。

1.2.2 對硝基苯酚法測定脂肪酶活力［3］

1.2.2.1 底物溶液配制 溶液A∶取對硝基苯基正辛酸酯(pNPC)、對硝基苯基棕櫚酸酯(pNPP)30mg，加入10mL異丙醇(3mg·mL－1);溶液 B∶Tritox X－1002g，阿拉伯膠 0.5g溶解于 450mL Tris－HCl (50mmol/L，pH8.0)。

P－NP底物溶液配制∶按溶液A∶溶液B=1∶9的比例配成乳狀液，將此溶液穩(wěn)定2h。

1.2.2.2 測定方法 參見Thomas Vorderwulbecke對硝基苯酚法測定。

1.2.2.3 酶活定義及計算公式 脂肪酶酶活力單位定義為∶在一定條件下，每分鐘釋放出1μmol對硝基苯酚的酶量定義為1個脂肪酶活力單位(U)。計算公式∶X=CV/(Tv')

式中∶X－脂肪酶活力，U·mL－1;C－對硝基苯酚濃度，μmol·mL－1;V－酸堿調(diào)節(jié)后的反應(yīng)液終體積，mL;v'－酶液的用量，mL;T－反應(yīng)時間，min。

1.2.3 雅致放射毛霉脂肪酶酶學(xué)特性研究

1.2.3.1 最適作用pH［4］分別以pNPC和pNPP為底物，以不同pH(5.8、6.2、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0、9.0)的緩沖液配制底物，按1.2.2的方法測定脂肪酶活力，并繪制pH－絕對酶活曲線。

1.2.3.2 酸堿穩(wěn)定性 將粗酶液置于不同pH(5.8、6.2、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0、9.0)的緩沖液中，于4℃下放置不同時間，按1.2.2的方法測定脂肪酶活力，以最高酶活力為100%，將其余各pH下的酶活力換算成相對酶活，并繪制pH－相對酶活曲線。

1.2.3.3 最適作用溫度［4］分別以pNPC和pNPP為底物，以pH 7.0和7.5的緩沖液配制底物，在不同溫度條件下(25、30、35、40、45、50、55、60、70℃)，按1.2.2的方法測定脂肪酶活力，并繪制溫度－絕對酶活曲線。

1.2.3.4 熱穩(wěn)定性［5］a.以pNPC為底物，以pH7.0的緩沖液配制底物，在不同溫度下(30、35、40、50、60℃)分別保溫不同時間，按1.2.2的方法在30℃測定脂肪酶活力，其余同1.2.3.2。b.以pNPP為底物，以pH7.5的緩沖液配制底物，在不同溫度下(35、40、45、50、60℃)分別保溫不同時間后，按1.2.2的方法在35℃測定脂肪酶活力，其余同1.2.3.2。

1.2.3.5 不同氯化鈉濃度對脂肪酶活力的影響［4］分別以pNPC和pNPP為底物，以pH7.0和7.5的緩沖液，不同濃度NaCl溶液(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5mol/mL)配制底物，按1.2.2的方法測定脂肪酶活力。

1.2.4 腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力測定 在后期發(fā)酵過程中取5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、30、33、35、38、40、45d腐乳樣品按1.1.2提取粗酶液，按1.2.1和1.2.2方法分別測定脂肪酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 雅致放射毛霉脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.1.1 雅致放射毛霉脂肪酶最適pH和酸堿穩(wěn)定性

如圖1所示，當采用pNPP為底物時，在pH為7.0時脂肪酶表現(xiàn)出最高活力(0.1004U·mL－1)，之后隨著pH的增加，酶活迅速下降，在pH8.0時，酶活低至10%。然而，當?shù)孜餅閜NPC時，pH為7.5時脂肪酶才呈現(xiàn)出最高活力(0.09967U·mL－1)，此后逐漸下降，在pH8.0時酶活仍達到87.95%。由此表明脂肪酶作用于不同的底物時其最適pH不同，對短鏈底物pNPC的水解作用較長鏈底物pNPP更傾向于在堿性條件下進行。與肖春玲［6］報道的毛霉M2脂肪酶的最適pH為8.0相比，用pNP方法測得的最適pH要低一些。在后面測定雅致放射毛霉脂肪酶活力時，以pNPC為底物，取最適pH=7. 5;pNPP為底物，取最適pH=7.0。

圖1 不同pH對脂肪酶活力的影響

從圖2、圖3中可以看出，無論底物是pNPC還是pNPP，粗酶液在pH7.0～8.0范圍內(nèi)脂肪酶活力呈現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，在30h時，pNPC和pNPP酶活力均達到85%以上，然而在酸性條件下(pH=6.2)，60h后酶活力僅為25%。由此表明，雅致放射毛霉脂肪酶在中性偏堿性的條件下具有較好的穩(wěn)定性，而在酸性條件下，酶活迅速下降。

圖2 雅致放射毛霉脂肪酶酸堿穩(wěn)定性研究(對硝基苯酚正辛酸酯)

圖3 雅致放射毛霉脂肪酶酸堿穩(wěn)定性研究(對硝基苯酚棕櫚酸酯)

pNPP是長鏈底物，而pNPC是短鏈底物，前者比后者的親油性更強，可以推測在o/w乳狀液的反應(yīng)體系中，親水親油性的差異會影響該底物在乳狀液中的位置，從而會影響到與酶的不同結(jié)合性和酶活力。Kierkels［7］研究表明，脂肪酶活力大小與界面的

屬性特征有直接的關(guān)系。Lima［8］報道中提到的脂肪酶活力不但取決于pH，而且與使用的緩沖液類型也存在一定關(guān)系。Lima在文獻中報道了接觸面面積的大小決定了脂肪酶反應(yīng)的快慢，然而接觸面面積卻是由不同底物類型所決定的，不同類型的底物決定了乳化液的性質(zhì)。

2.1.2 雅致放射毛霉脂肪酶的最適作用溫度及耐溫的穩(wěn)定性 從圖4中可以看出，當?shù)孜餅閜NPC時，雅致放射毛霉脂肪酶在30～40℃溫度范圍內(nèi)具有相對較高的酶活力，在 30℃時酶活力表現(xiàn)最高(0.2902U·mL－1)，當溫度高于30℃時，其水解酶活隨著溫度的升高開始下降，70℃時，基本失活。采用pNPP為底物時，大致變化趨勢與pNPC相同，但是其在35℃時脂肪酶的活力表現(xiàn)最高(0.2803U·mL－1)，隨著作用溫度升高和降低，酶活力均呈現(xiàn)出減弱的趨勢。

從圖5、圖6中可知，雅致放射毛霉AS 3.27脂肪酶在30℃恒溫4h，保持85%左右的水解酶活力。在40℃時則保持酶活60%。而在60℃恒溫處理4h時，其水解活力下降至20%以下。在低于50℃的保溫條件下，脂肪酶在以長鏈的pNPP為作用底物時較之以短鏈的pNPC為作用底物，表現(xiàn)出了更好的耐溫穩(wěn)定性。

圖5 雅致放射毛霉脂肪酶熱穩(wěn)定性的影響(pNPC)

圖6 雅致放射毛霉脂肪酶熱穩(wěn)定影響研究(pNPP)

關(guān)于脂肪酶溫度的研究報道各不相同，Lima［8］中敘述到總的來說，霉菌的脂肪酶在溫度高于40℃時，脂肪酶表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。然而 Costa［9］關(guān)于P.wortmanii脂肪酶的報道中敘述到此酶在50℃恒溫60min時，脂肪酶的相對活力仍舊保持在55%以上。肖春玲［6］報道了毛霉 M2脂肪酶的酶最適溫度為50℃，在50～60℃溫度范圍內(nèi)脂肪酶活力較為穩(wěn)定。

2.1.3 雅致放射毛霉脂肪酶的最適鹽濃度 以pNPP和pNPC為底物在其最適條件下(pNPC∶pH7.5，30℃;pNPP∶pH7.0，35℃)比較了不同濃度NaCl對維持脂肪酶活性的作用。結(jié)果表明(圖7)，pNPC和pNPP的最適鹽濃度均為0.20mol/L，對應(yīng)的脂肪酶活力分別為0.09376、0.1247U·mL－1。隨著NaCl濃度的增加，脂肪酶活力呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢。從圖7中可以看出，以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，當NaCl濃度大于0.20mol/L之后，隨著NaCl濃度的增加，酶活力下降比對硝基苯酚正辛酸酯的要迅速。

圖7 NaCl濃度對脂肪酶活力的影響

2.2 AS 3.27腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力研究

腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力分別采用了對硝基苯酚法和堿滴定法兩種方法進行測定，脂肪酶活力變化如圖8所示，隨著后期發(fā)酵的進行，脂肪酶活力基本都呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。這可能是因為在后期發(fā)酵過程中腐乳的pH低于6.8，且持續(xù)下降(第5d pH為6.71，第10d pH為6.66，第15d pH 6.63到第40d pH 6.53)，而AS 3.27脂肪酶穩(wěn)定性的結(jié)果表明，在該pH范圍內(nèi)脂肪酶活力很不穩(wěn)定(圖2)。

圖8 后期發(fā)酵過程中雅致放射毛霉脂肪酶活力變化

由圖8中可見，聚乙烯醇－橄欖油和對硝基苯酚正辛酸酯的變化趨勢基本相同，然而對硝基苯酚棕櫚酸酯在1～18d內(nèi)的下降幅度更加大。在20～25d的后酵階段，脂肪酶活力均出現(xiàn)很小幅度的增加現(xiàn)象。這與魯緋［10］的報道中脂肪酶活力在整個發(fā)酵過程中表現(xiàn)出的極其不穩(wěn)定的結(jié)論不同。我們推測可能是在此階段其它參與發(fā)酵的微生物如乳酸菌分泌的脂肪酶所致。這一趨勢在相關(guān)文獻中未見報道，需要進一步的研究。

3 結(jié)論

本文首次使用對硝基苯酚法采用pNPC和pNPP兩種不同底物對AS 3.27脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)及腐乳后期發(fā)酵時的脂肪酶活力進行了研究。結(jié)果表明，采用pNPC和pNPP兩種不同的底物，測得的脂肪酶最適作用條件有所不同，耐溫穩(wěn)定性也有差異。腐乳后期發(fā)酵過程中脂肪酶活力呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢，20～25d這個階段有小幅度的反復(fù)，這與堿滴定法測定的結(jié)果相同，但是與魯緋已報道的脂肪酶活力研究結(jié)果大不相同，還有待于進一步研究。

［1］王瑞芝.論影響腐乳后發(fā)酵的主要因素［J］.中國調(diào)味品，2005(7):4－9.

［2］江慧芳，王雅琴，劉春國.三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進［J］.化學(xué)與生物工程，2007，24(8):72－75.

［3］Thomas Vorderwulbecke.Comparison of lipases by different assays［J］.Enzyme Microbiology Technology，1992(14): 631－635.

［4］張萌.嗜鹽脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及粗酶性質(zhì)［J］.微生物學(xué)通報，2009，36(1):14－19.

［5］戴斐，張雍容，江正兵.釀酒酵母表面展示脂肪酶LipB52的酶學(xué)性質(zhì)［J］.華東理工學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，33(2): 177－181.

［6］肖春玲.毛酶脂肪酶的研究［J］.微生物學(xué)通報，1998，25 (5):274－277.

［7］JGT Kierkels et al.Pseudomonas fluorescenslipase adsorption and the kinetics of hydrolysis in a dynamic emulsion system［J］. Enzyme Microbe Technology，1994(16):513－521.

［8］V M G Lima，et al.Activity and stability of a crude lipase fromPenicillium aurantiogriseumin aqueous media and organic solvents［J］.Biochemical Engineering，2004(18):65－71.

［9］MAF Costa，RM Perelta.Production of lipase by soil fungi and partial characterization of lipase from a selected strain［J］.Basic Microbiology，1999(39):11－15.

［10］魯緋.對腐乳后酵過程中一些成分變化的研究［J］.中國釀造，2003(6):14－17.

Determination on lipase enzymatic characteristics and activity of Actinomucor elegans by pNP method

LI Bei，LI Xiao－h(huán)ui，YI Jie－rong*
(College of Food，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Actinomucorr elegans AS 3.27 lipase activities after cultivation and during sufu mature process were determined by pNP method with substrates of different carbon length.Differences in enzymatic characteristics were observed with different substrates－pNPC and pNPP.The optimum temperature was 30，35℃，and the optimum pH was 7.5，7.0 for pNPC and pNPP，respectively.While the optimum concentrations of NaCl were the same(0.20mol/L). No significant differences in lipase activity of sufu during the mature process existed between pNPC and pNPP method.The lipase activity of sufu decreased gradually during the ripening process，but during the period of 20～25 days，activity recurrent by a small margin.Simultaneously，the titrimetric method(substrate:PVA－olive oil)was applied to verify.The same trend was proved.

pNP;pNPC;pNPP;lipase;Actinomucor elegans AS 3.27

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)11－0220－04

2010－10－25 *通訊聯(lián)系人

李蓓(1986－)，女，碩士在讀，研究方向:食品加工和食品化學(xué)。