蛋白質(zhì)氧化機制及其評價技術(shù)研究進(jìn)展

朱衛(wèi)星，王遠(yuǎn)亮，李宗軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128)

蛋白質(zhì)氧化機制及其評價技術(shù)研究進(jìn)展

朱衛(wèi)星，王遠(yuǎn)亮，李宗軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128)

肉制品在貯藏一段時間后，顏色會變成讓人難以接受的程度，為肉制品的銷售帶來不利影響。肉制品顏色的變化在一定程度上與蛋白質(zhì)氧化有很大地關(guān)系。對肉制品中蛋白質(zhì)氧化的研究有助于延緩肉制品顏色的劣變，提高肉制品的貨架期。主要就蛋白質(zhì)氧化的機理、氧化后蛋白質(zhì)發(fā)生的主要變化以及氧化后蛋白質(zhì)的評價技術(shù)作了闡述，旨在建立食品中蛋白質(zhì)氧化的完善評價機制。

蛋白質(zhì)，氧化，變化，評價

1 蛋白質(zhì)氧化的機制

蛋白質(zhì)氧化［6］，是指血漿或組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)在自由基及其相關(guān)氧化物的作用下，某些特定的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)上的變化，對氧化物的親和力增強，易于水解、聚合、交聯(lián)作用而導(dǎo)致細(xì)胞功能性損害［7］。

肌肉組織中含有或者產(chǎn)生反應(yīng)性氧系(reactive oxygen species，ROS)，ROS包括:羥基自由基(HO·)、超氧自由基陰離子(O2-·)、NO、過氧化物自由基(ROO·)、過氧化氮自由基(ONOO-)、單氧(1O2)、次氯酸(HClO)、過氧化氫(H2O2)。還有其他一些活性的醛基和酮基。活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，RNS主要指含氮自由基及其衍生物，如NO·、ONOO-及ONOOH。它們都是引起蛋白質(zhì)氧化損傷的重要因素。

在體內(nèi)環(huán)境和體外實驗中，吞噬細(xì)胞的活化作用被認(rèn)為通過呼吸作用產(chǎn)生 H2O2和過氧陰離子(O2-·)并釋放亞鐵血紅素過氧化物酶，這種酶可以催化H2O2和通過生理作用產(chǎn)生的Cl-形成具有強氧化活性的HClO。HClO可以和許多具有生物意義的物質(zhì)反應(yīng)，比如:蛋白質(zhì)、DNA、脂肪、膽固醇等，其中的蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)HClO最大的攻擊目標(biāo)，但要取決于它們各自的量的多少。通過對反應(yīng)速度常數(shù)的確定，與HClO反應(yīng)的氨基酸順序如下:

Met＞Cys?Cystine～His～α-amino＞Lys?Tyr～Arg＞Gln～Asn［8］。

羥自由基(·OH)是人體內(nèi)最重要的自由基。因此對羥自由基的消除率作為反映藥物抗氧作用的重要指標(biāo)。羥自由基(·OH)有反應(yīng)活性大、壽命短(小于10-4s)、存在濃度低的特點。韓鶴友［9］等、王仕良［10］等都對羥自由基的產(chǎn)生及測定進(jìn)行了研究。

蛋白氧化和脂類的氧化被證實都是由自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引起的，ROS與蛋白質(zhì)的氧化反應(yīng)歷程包括:去氫、電子傳遞、加成、斷裂和重排、二聚、歧化和取代。跟脂肪氧化一樣，同樣包括:起始、傳遞、終止三個階段［11］。

表1 蛋白質(zhì)被氧化的脂類催化發(fā)生氧化的可能作用機制(L=lipid;P=protein)

2 氧化過程中蛋白質(zhì)所發(fā)生的主要變化

自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化致使多肽鏈發(fā)生氧化斷裂、蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸發(fā)生氧化修飾、以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。

蛋白質(zhì)不含有天然存在的羰基基團(tuán)，它們主要是靠氧化機制引入到蛋白質(zhì)中的。如賴氨酸的α-氨基的氧化脫氨基作用、脯氨酸和精氨酸中第二位上碳原子的氧化作用都可以形成羰基基團(tuán)［12］。蛋白質(zhì)的羰基物質(zhì)能夠通過以下四種途徑產(chǎn)生［14］:氨基酸側(cè)鏈的直接氧化;肽骨架的斷裂;和還原糖反應(yīng);結(jié)合非蛋白羰基化合物。蛋白質(zhì)氧化過程中的脫氨反應(yīng)可能是產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基的主要反應(yīng)。此外，羥自由基可引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞，在斷裂處產(chǎn)生羰基。

蛋白質(zhì)在氧化過程中，巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵是蛋白質(zhì)氧化過程中的顯著變化，它可以作為蛋白質(zhì)氧化的指標(biāo)之一。

蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸的-SH可被氧化形成二硫鍵，酪氨酸可氧化形成二酪氨酸，這樣可造成蛋白質(zhì)交聯(lián)。在乳中的研究也證明，通過半胱氨酸的巰基氧化形成二硫鍵連接、兩個氧化的酪氨酸殘基的絡(luò)合作用可生成由ROS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)間交聯(lián)衍生物。但二酪氨酸作為蛋白質(zhì)氧化損傷的指標(biāo)要受到蛋白質(zhì)樣品種類的限制。

氧化誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，使非極性殘基不斷暴露，這將導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的疏水性發(fā)生變化。

3 食品中蛋白質(zhì)氧化的評價及主要研究方法

崔旭海［6］等在對乳蛋白氧化的研究中指出，由蛋白質(zhì)氧化引起的蛋白物理化學(xué)改變，會增加或降低乳蛋白質(zhì)凝膠能力，并進(jìn)一步影響乳蛋白的乳化及保水能力。在肉和肉制品的研究方面，蛋白質(zhì)氧化可使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這一變化將引起蛋白質(zhì)溶解性的損失，進(jìn)而改變?nèi)庵破分心z性、乳化性、粘性、溶解性和水合作用。氧化引起的肉制品的變色問題，可能是其中的血紅素鐵或者多肽部分被氧化，或者是二者皆有的氧化所引起的，還需做進(jìn)一步的研究［14］。

3.1 蛋白質(zhì)氧化與羰基含量

羰基的形成(醛基和酮基)是被氧化蛋白質(zhì)中的一個顯著變化。蛋白質(zhì)羰基含量是蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感指標(biāo)，且相對較容易測量［13］。

孔保華［15］等利用體外羥自由基(·OH)產(chǎn)生氧化體系(hydroxyl radical generating system，HRGS)，主要由FeCl3、Asc(抗壞血酸)和H2O2通過鐵的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基。Fenton類型的反應(yīng)是生物體系中形成羥自由基的主要反應(yīng)。Asc是強還原劑，可將FeCl3中的Fe3+還原成Fe2+，之后Fe2+又和強氧化劑H2O2反應(yīng)生成·OH，其反應(yīng)方程式如下:

Fe2++H2O2→·OH+OH-Fenton反應(yīng)

上述反應(yīng)生成的羥自由基攻擊蛋白質(zhì)的側(cè)鏈或肽鍵，形成蛋白過氧化物。他們認(rèn)為，如果這些過氧化物是在α-碳原子或其他氨基酸殘基的碳原子上，就會使羰基含量增加，轉(zhuǎn)化成羰基基團(tuán)。這就是蛋白氧化后蛋白質(zhì)羰基含量增加的原因。

常用的檢測蛋白質(zhì)羰基含量的方法主要有:硼氫化鈉法［16］、熒光素肼法、熒光胺法、免疫雜交法［17］和酶聯(lián)免疫法［18］等。2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法是測定蛋白羰基含量的最常用的方法。其原理為:蛋白氧化后形成的羰基可與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成紅棕色的2，4-二硝基苯腙沉淀，此沉淀用鹽酸胍溶解后，在分光光度計上370nm處有吸光度值，從而測出蛋白質(zhì)中的羰基含量［19］。其含量用每毫克蛋白中含有多少μmol的羰基來表示。這是測定的經(jīng)典方法，適合實驗室的一般測定。也可以利用與2，4-二硝基苯肼作用，生成棕色物質(zhì)后再采用紫外分光光度法、HPLC或質(zhì)譜檢測。也可用抗-2，4-DNP抗體，利用Western印跡、免疫組化及ELISA法檢測。

3.2 蛋白質(zhì)氧化與巰基含量

蛋白質(zhì)在氧化過程中，巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵是初期的一個反應(yīng)產(chǎn)物［20］。崔旭海［21］等在乳制品中的研究認(rèn)為，巰基的降低可能是因為氧化在乳清蛋白多肽分子之間或內(nèi)部形成了二硫鍵，或者是進(jìn)一步氧化成磺酸類或其他氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)表面的總巰基含量的下降。

Ellman法是目前測定蛋白質(zhì)中游離巰基和二硫鍵含量的快速、簡便的方法。歐仕益［22］等、劉莉［23］等均采用Ellman法分別測定了豆奶蛋白及血清中總巰基含量。它是Ellman在1959年發(fā)明的，即利用5， 5’-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)與游離-SH反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物是一種在412nm處生成有最大吸收峰的黃色物質(zhì)，采用分光光度法測定。該法簡單、快速、直接，是測定純蛋白質(zhì)溶液中巰基的一種理想方法。

3.3 蛋白質(zhì)氧化后的二聚酪氨酸含量

蛋白經(jīng)過·OH氧化修飾后，二聚酪氨酸是一個有效的測定指標(biāo)［24］。崔旭海［21］等在乳清蛋白氧化的研究中，是參考Davies描述的方法測定乳清蛋白中二聚酪氨酸含量的［25］?？妆ＨA［15］等在乳清分離蛋白氧化的研究中，二聚酪氨酸含量也是采用上述方法。此方法是將蛋白溶解在pH為6.0的高離子強度的磷酸鹽緩沖液中，該溶液中含有濃度為0.6 mol/L的KCl，溶液經(jīng)濾紙過濾除去不溶性物質(zhì)后用熒光分光光度計進(jìn)行測定。李冰冰［32］等研究指出二酪氨酸可以作為蛋白質(zhì)氧化損傷的指標(biāo)，但這種指標(biāo)受到蛋白質(zhì)樣品種類的限制。具體使用Amado方法，采用325nm的激發(fā)光，415nm處發(fā)射熒光，測定其熒光值。Hanan等［26］和Kristensen等［27］研究發(fā)現(xiàn)肌球蛋白經(jīng)氧化修飾后二聚酪氨酸的含量增加。采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS)也可以檢測酪氨酸殘基氧化產(chǎn)物。GC/MS法可以在復(fù)雜的混合物中準(zhǔn)確定量痕量的待分析物，是一種特異、敏感和精確定量蛋白質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物的方法。而有關(guān)蛋白氧化后二聚酪氨酸其它方面的研究還未見報導(dǎo)。

3.4 蛋白質(zhì)氧化與其表面疏水性

蛋白質(zhì)分子的表面疏水性比整體的疏水性對蛋白質(zhì)功能的影響更大。測定蛋白表面疏水性的方法有兩種，一種是目前使用比較廣泛的，可以測定蛋白質(zhì)平均疏水值的熒光探針法［28］;另一種是后來Kato［29］等提出的，是疏水探針法的一種，即SDS結(jié)合法。耿瑋蔚［30］等在實驗中用這兩種方法作了比較，結(jié)果表明兩種方法具有較好的相關(guān)性。有關(guān)蛋白質(zhì)表面疏水性的經(jīng)驗方法已得到肯定，為進(jìn)一步探索表面疏水性的方法奠定了基礎(chǔ)。

3.5 蛋白質(zhì)氧化中的游離氨

孫研［33］等在測定上述常規(guī)指標(biāo)外，還提出了游離氨的測定。他參照管軍軍［34］的方法并進(jìn)行改進(jìn)，采用鄰苯二甲醛(OPA)法對蛋白中游離氨基進(jìn)行測定。實驗得出，游離氨含量的變化雖然跟羰基變化相關(guān)，但并不是線性關(guān)系。而在其它的文獻(xiàn)中未見把游離氨含量作為測定蛋白氧化的指標(biāo)。

4 展望

對由蛋白質(zhì)氧化引起乳及其制品如膠凝作用、乳化作用、水合作用或持水能力、攪打起泡性、微膠囊化等的變化、肉及肉制品膠凝作用和肉顆粒間的結(jié)合作用、乳化作用和水合作用或持水能力等功能性質(zhì)的改變有了一定的認(rèn)識，但蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化與功能性質(zhì)的改變還沒有細(xì)致深入的研究，尤其是蛋白質(zhì)氧化的評價才剛剛建立，有待更加完善。目前有關(guān)蛋白質(zhì)氧化方面的研究多集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人體內(nèi)自由基引起的蛋白質(zhì)氧化可引起如糖尿病、冠心病、腎病、帕金森氏病等眾多疾病，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有了相應(yīng)的檢測指標(biāo)。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展使蛋白質(zhì)氧化的研究也得到了較大的進(jìn)步，在近期的研究中，越來越多的氧化蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)組學(xué)［31］的研究方法被鑒定出來，并且從分子角度提出了一些影響蛋白質(zhì)氧化的因素。食品做為人類生活所必需，是以后蛋白質(zhì)氧化方面研究的重點，蛋白質(zhì)氧化檢測方法的研究任重而道遠(yuǎn)。

［1］Rabek JP，William H，Papaconstantionou J.Carbonylation of ER chaperone proteins in aged mouse liver［J］.Biochem Bioph Co，2003，305:566-572.

［2］Ufuk C，Akataya，Refik K，et al.Relation of aging with oxidative protein damage parameters in the rat skeletal muscle［J］.Clin Biochem，2003，36:51-55.

［3］Chandan K J，Nilanjana D，Rajindar S，et al.Specificity of agerelated carbonylation of plasma proteins in the mouse and rat［J］.Arch Biochem Biophys，2002，397:433-439.

［4］Cakatayl U，Telcil A，K ayali R，et al.Effect of α-lipoic acid supplementation on oxidative protein damage in the streptozotocin -diabetic rat［J］.Res Exp Med，2000，199:243-251.

［5］Zsolt RA，Takao K，Shoichi T，et al.The effect of exercise training on oxidative damage of lipids，proteins，and DNA in rat skeletal muscle［J］.Free Radical Bio Med，1999，27:69-74.

［6］崔旭海，孔保華.蛋白氧化及對肉制品品質(zhì)和功能性的影響［J］.肉類研究，2008(11):27-31.

［7］吳志賢，薛耀明.蛋白質(zhì)氧化的研究進(jìn)展［J］.臨床檢驗雜志，2007，25(6):476-477.

［8］Hawkins C L，Pattison D I，Davies M J.Hypochlorite-induced oxidation of amino acids，peptides and proteins［J］.Amino Acids，2003，25:259-274.

［9］韓鶴友，何治柯，曾云鶚.羥自由基的分析研究進(jìn)展［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2001，17(1):84-86.

［10］王仕良，張曾，黃干強.羥基自由基的產(chǎn)生與測定［J］. Paper Science and Technology，2003，22(6):45-47.

［11］Schaich K M.Free radical initiation in proteins and amino acids by ionizing and ultraviolet radiations and lipid oxidationⅢ: Free radical transfer from oxidizing lipids［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1980(13):189-244.

［12］Dragsted L O.Biomarkers of exposure to vitamins A，C，and E and their relation to lipid and protein oxidation markers［J］.Eur J Nutr，2008，47(2):3-18.

［13］Levine R L，Garland D，Oliver C N.Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins［J］.Methods in Enzymology，1990，186:464-477.

［14］Xiong Y L.Protein oxidation and implications for muscle food quality［M］.Antioxidations in Muscle Foods.Edited by Eric Decker，Cameron Faustman，Clemente［J］.Lopez-Bote，2000: 85-111.

［15］孔保華.抗氧化劑對羥自由基引起的乳清分離蛋白氧化抑制效果的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(3):5-10.

［16］Yan LJ，Rajindar SS.Gel electrophoretic quantitation of protein carbonyls derivatized with tritiated sodium borohydride［J］.Anal Biochem，1998，265:176-182.

［17］Robinson CE，Keshavarzian A，Pasco DS，et al.Determination of protein carbonyl groups by immunoblotting［J］.Anal Biochem，1999，266:48-57.

［18］Hendrikje B，Timothy PC，Karl B，et al.Winterbourn protein carbonyl measurement by aensitive Elisa method［J］.Free Radical Bio Med，1997，23:361-366.

［19］Akio S，Takahiro Y，K azuya I，et al.Trace analysis of carbonyl compounds by liquid chromatography mass spectrometry after collection as，dinitrophenylhydrazine derivatives［J］.J Chromatogr A，1999，844:403-408.

［20］DEAN R T，F(xiàn)U S，STOCHKER R，et al.Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation［J］.J Biol Chem，1997，324:1-18.

［21］崔旭海，孔保華，熊幼翎.自由基氧化引起乳清蛋白理化性質(zhì)變化的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2008，36(9):31-34.

［22］歐仕益，郭乾初，包惠燕，等.豆奶蛋白質(zhì)中琉基含量的測定［J］.中國食品學(xué)報，2003，3(2):59-62.

［23］劉莉，李梅.血清總巰基含量的測定［J］.實用醫(yī)學(xué)進(jìn)修雜志，1996，24(2):97-99.

［24］DAVIES K J A，DELSIGNORE M E，LIN S W.Protein damage and degradation by oxygen radicals II:Modification of amino acids［J］.Journal of Biological Chemistry，1987，262:9902 -9907.

［25］DAVIES K J A，DELSIGNORE M E，LIN S W.Protein damage and degradation by oxygen radicals.Ⅱ:Modification of amino acids［J］.J Biol Chem，1987，262:9902-9907.

［26］HANAN T，SHAKLAI N.The role of H2O2-generated myoglobin radical in cross linking of myosin［J］.Free Radical Research，1995，22(3):215-227.

［27］KRISTENSEN L，MOLLER A J，ANDERSEN H J. Degradation myosin by cathepsin B.Comparison of native and oxidatively modified protein.Proceedings of 43rd international congress of meat science and technology［C］.New Zealand: Auckland，1997.

［28］黃曼，卞科.蛋白質(zhì)疏水性測定方法研究進(jìn)展［J］.糧油食品科技，2004，12(2):31-32.

［29］KATOA，MATSUDA T，MATSUDOMIN，etal. Determination of protein hydrophobicity using sodium dodecyl sulfate binding method［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1984，32(2):284-288.

［30］耿瑋蔚，楊光，謝欣怡，等.SDS結(jié)合法測定蛋白質(zhì)的疏水性［J］.食品科學(xué)，2009，30(24):416-418.

［31］伏毅，譚曉榮.植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)氧化研究進(jìn)展［J］. 2008，29(6):82-85.

［32］李冰冰，趙倩，張龍富.活性氧與蛋白質(zhì)氧化損傷［J］.平頂山工學(xué)院學(xué)報，2005，14(5):16-17.

［33］孫妍，孔保華，劉騫.羥基自由基氧化體系對乳清蛋白、β-乳球蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響［J］.食品科學(xué)，2009，30(11): 17-21.

［34］管軍軍，裘愛泳，劉曉亞，等.加熱方式對大豆分離蛋白-糖接枝反應(yīng)的影響［J］.中國油脂，2005，30(6):53-56.

Research progress of protein oxidation mechanism and evaluation technology

ZHU Wei-xing，WANG Yuan-liang，LI Zong-jun
(The College of Food Science and Technology of Hunan Agricultural University，Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China)

The color of meat products becomes unacceptably when they are stored for a period of time，it brings adverse impact when they are sold.It has the very big relations between meat color changes and protein oxidation in a certain extent.The research of protein oxidation in meat products may help to slow the meat color deterioration，improve the meat shelf life.The article is aim to discuss the principle of protein oxidation，the main changes after the proteins are oxidized and the evaluation of protein oxidation in order to establish the better evaluation system of protein oxidation in foods.

protein;oxidation;change;evaluation

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)11-0483-04

蛋白質(zhì)不僅是生物體的重要組成成分，而且在生命活動中擔(dān)負(fù)著催化、調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運、貯存、運動和支架作用等功能。蛋白氧化是肉制品功能性質(zhì)改變的重要原因。蛋白質(zhì)在自由基的作用下，可發(fā)生包括脂質(zhì)過氧化加合物的生成、二硫鍵的連接、酪氨酸側(cè)鏈的硝基化和氨基酸的羰基化等一系列共價修飾作用［1］。現(xiàn)有關(guān)蛋白質(zhì)氧化的研究主要集中在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域。在體內(nèi)外環(huán)境中，蛋白質(zhì)是自由基和其它氧化劑攻擊的主要目標(biāo)。氧化使蛋白質(zhì)的功能喪失，可以影響到酶的活性、受體、膜轉(zhuǎn)運蛋白等蛋白質(zhì)的正常功能，可引起諸如衰老［2-3］、糖尿?。?］、帕金森氏病(parkinson disease，PD)等一系列疾病。更嚴(yán)重的是，當(dāng)機體處于過度運動［5］時也會引起蛋白質(zhì)的氧化損傷。蛋白質(zhì)在體外自由基的作用下，其羰基含量、巰基含量、二聚酪氨酸含量、表面疏水性等方面已作為蛋白質(zhì)氧化測定的指標(biāo)。有關(guān)蛋白氧化產(chǎn)物測定方面的研究還很少，還沒有建立起完善的氧化機制。食品當(dāng)中蛋白氧化測定指標(biāo)的進(jìn)一步研究，對提高產(chǎn)品質(zhì)量、保護(hù)人體健康方面具有重要的現(xiàn)實意義。

2010-11-16 *通訊聯(lián)系人

朱衛(wèi)星(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

長沙市重點科技項目資助(K1001081-21)。