朱黃青霉α-1,6-葡聚糖酶在畢赤酵母中的分泌表達

莊靈習，段 然，陳龍軍，凌雪萍，盧英華，*

(1.廈門大學化學化工學院，福建廈門361005; 2.廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東廣州510316)

朱黃青霉α-1,6-葡聚糖酶在畢赤酵母中的分泌表達

莊靈習1，段 然1，陳龍軍2，凌雪萍1，盧英華1，*

(1.廈門大學化學化工學院，福建廈門361005; 2.廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東廣州510316)

α-1，6-葡聚糖酶是專一作用于α-1，6糖苷鍵產(chǎn)生小分子葡聚糖的一類水解酶，廣泛的運用于制糖工業(yè)和啤酒工業(yè)中。采用PCR法擴增朱黃青霉(Penicillium minioluteum)C12114的α-1，6-葡聚糖酶基因，將其插入畢赤酵母表達載體pPIC9K。經(jīng)Sac I酶線性化電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母基因組，構(gòu)建重組酵母GS115/pPIC9K-dex。對構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)化子進行1.5%的甲醇誘導表達，在30℃條件下培養(yǎng)7d時酶活達到最大值，為88.35U/mL。

α-1，6-葡聚糖酶，朱黃青霉，畢赤酵母，誘導

1 材料與方法

1.1 實驗材料

朱黃青霉C12114和大腸桿菌E.coli DH5α 由本實驗室保存;畢赤酵母表達載體pPIC9K和畢赤酵母菌株GS115 Invitrogen公司;膠回收試劑盒、酵母基因組提取試劑盒 深圳尚能生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體系統(tǒng)和T4 DNA連接酶 日本TaKaRa公司;DNA相對分子質(zhì)量標準、Taq DNA聚合酶 大連寶生物工程公司;質(zhì)粒提取試劑盒、無氨基酸的硫酸銨酵母氮源培養(yǎng)基、抗生素G418、蛋白分子標準 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;測序及引物合成 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成;其他生化試劑 國產(chǎn)分析純;朱黃青霉斜面培養(yǎng)基PDA(g/L) 酵母膏5，葡萄糖10，瓊脂20，自然pH;朱黃青霉菌絲體液體培養(yǎng)基(g/L) 玉米漿20，蔗糖20，酵母膏5，CaCO35，pH 5.8;LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌DH5α培養(yǎng)，YPD、MD培養(yǎng)基用于重組畢赤酵母的篩選，BMG和BMM培養(yǎng)基用于重組畢赤酵母的培養(yǎng)表達，具體配方見Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊［8］;引物 使用引物序列如表1所示，其中 F1、F2為朱黃青霉C12114中α-1，6-葡聚糖酶基因的上下游引物，在上游引物F1的5’端引入EcoR I酶切位點，下游引物F2的5’端引入Not I酶切位點(表中劃線部分)。

表1 實驗相關(guān)引物

1.2 實驗方法

1.2.1 朱黃青霉的菌體培養(yǎng)、DNA的提取及dex基因的獲得 將PDA斜面培養(yǎng)基(30℃恒溫培養(yǎng))上的朱黃青霉C12114接種至菌絲體液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min搖床培養(yǎng)約3～4d。離心收集菌絲，無菌水沖洗，液氮速凍，研磨后參照吳發(fā)紅等［9］使用SDS法提取朱黃青霉的總DNA。

以獲得的總DNA為模板，PCR擴增dex基因。反應(yīng)體系含4μL 25mmol/LMgCl2、0.5μL 10mmol/L dNTP、0.5μL(2.5U)Taq DNA聚合酶、各 0.5μL 10μmol/L的上下游引物(F1和F2)和總DNA模板0.5μL，擴增條件見表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收預(yù)期大小的片段，與pMD-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含氨芐青霉素LB平板上，挑選陽性克隆，提質(zhì)粒進行測序驗證。

1.2.2 重組畢赤酵母表達載體的構(gòu)建 將測序正確定義的α-1，6-葡聚糖酶基因用EcoR I和Not I雙酶切，并與同樣經(jīng)過 EcoR I和 Not I雙酶切的載體pPIC9K連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)氨芐抗性和卡那霉素選擇篩選出陽性克隆。提取質(zhì)粒進行測序驗證，構(gòu)建重組載體pPIC9K-dex，如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-dex

1.2.3 重組畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選 將活化后的畢赤酵母 GS115菌株接種到30mL YPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)過夜至 OD600為1.0～1.5。取5mL 4℃離心并收集菌體，用預(yù)冷的無菌水和1mol/L山梨醇分別洗滌菌體兩次，將所得菌體懸浮于80μL預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液中。加入20μL經(jīng)Sac I線性化的重組表達載體充分混勻，將上述混合液移至0.2cm電擊杯中，冰浴5min，用電轉(zhuǎn)化儀電擊，條件為1500V，25μF。電擊結(jié)束后向電擊杯內(nèi)加入1mL預(yù)冷的1mol/L山梨醇溶液，分別取200、300、500μL涂布于缺少組氨酸的MD平板，30℃條件下培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。以不含載體的GS115為陰性對照。

用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子分別點種到含0.25、0.5、1.0、1.5、2g/L G418的YPD培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2d，在高濃度G418平板上生長的即為高拷貝轉(zhuǎn)化子。獲得的高拷貝轉(zhuǎn)化子點種于篩選培養(yǎng)基MM和MD平板上，確定其甲醇利用表型，在MD和MM上均能正常生長的轉(zhuǎn)化子為Mut+(methanol utilization plus)型，指可利用甲醇為唯一碳源的野生型菌株。將獲得的高拷貝轉(zhuǎn)化子點種于MM-藍色葡聚糖T2000平板，出現(xiàn)透明水解圈則是表達成功的陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 重組畢赤酵母菌株的誘導表達 將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含30mL BMG培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h。離心收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)移至30mL BMM誘導培養(yǎng)基中，30℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)168h，每24h補加適量甲醇至體積分數(shù)1%。每24h取樣，10000r/min離心5min，收集上清液即為粗酶液。

1.2.5 SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物 將粗酶液進行SDS-PAGE(分離膠12%，濃縮膠5%)，粗酶液加入4×上樣緩沖液，沸水浴5min后上樣10μL進行電泳。電泳結(jié)束后采用銀染法顯色［10］。

1.2.6 重組畢赤酵母表達產(chǎn)物分析 采用DNS法［11］測定重組α-1，6-葡聚糖酶的活性。酶活定義在pH5.0，溫度37℃下，將每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.2.7 重組畢赤酵母搖瓶優(yōu)化 以BMG培養(yǎng)基為生長培養(yǎng)基，BMM為誘導培養(yǎng)基，分別考察誘導溫度和甲醇濃度對蛋白表達的影響。選擇誘導溫度分別為25、28、30、32℃進行優(yōu)化;分別在誘導過程中添加0.5%、0.75%、1.0%、1.5%、2.0%體積分數(shù)的甲醇，測定重組α-1，6-葡聚糖酶的活性，選擇合適的甲醇添加濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 dex基因的獲得

經(jīng)菌絲體培養(yǎng)基培養(yǎng)朱黃青霉后，采用液氮-SDS法提取總DNA，結(jié)果如圖2所示。圖2中泳道1和2分別為未添加及添加液氮研磨的結(jié)果。在研磨過程中由于液氮對細胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護作用，可以看出泳道2的條帶比較亮，DNA提取效果較好。

圖2 朱黃青霉C12114的總DNA

提取的總DNA經(jīng)溫度梯度PCR擴增得到目的基因約為1800bp，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)測序后，與朱黃青霉α-1，6-葡聚糖酶基因具有100%同源性，至此成功獲得dex基因。將dex基因連入T載體，挑取含氨芐青霉素平板上的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，成功得到載體pMD18-T-dex(圖略)。

圖3 α-1，6-葡聚糖酶基因擴增結(jié)果注:1-DNA ladder;2～9-不同退火溫度40、42、44、46、48、50、52、54℃擴增片段。

2.2 重組載體pPIC9K-dex的構(gòu)建

將重組體pMD18-T-dex和載體pPIC9K分別經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切，回收相應(yīng)片段、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取轉(zhuǎn)化子擴增并抽提質(zhì)粒。將抽提的質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切，得到了1800bp左右和9000bp左右的條帶(見圖4)，證實dex基因成功插入載體pPIC9K，將重組質(zhì)粒命名為pPIC9K -dex。

圖4 雙酶切驗證重組質(zhì)粒pPIC9K-dex注:M-DNA ladder;1-經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切片段。

2.3 重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-dex的構(gòu)建與篩選

重組質(zhì)粒用Sac I酶切線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上篩選目的基因整合到宿主菌染色體上的轉(zhuǎn)化子?？紤]到基因拷貝數(shù)的增加一般可以提高基因產(chǎn)物的表達量，首先利用載體上的G418抗性基因篩選高基因拷貝的轉(zhuǎn)化子。將MD平板上獲得的轉(zhuǎn)化子點種于含0.25、0.5、1、1.5和2g/L G418的 YPD平板上，30℃培養(yǎng) 3d后，篩選出抗1.5mg/mL G418的 5株菌，一般每抗 0.25mg/mL G418即為一個拷貝數(shù)，因此最終得到約6個拷貝數(shù)的重組畢赤酵母。從MD平板點種到MM上的轉(zhuǎn)化子都能生長且菌落比MD平板上的小，故判斷其甲醇利用表型為Mut+。

將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子點板于MM-藍色葡聚糖T2000平板，結(jié)果見圖5。在菌落周圍可以明顯見到透明水解圈，證明dex基因不僅已經(jīng)整合進酵母基因組中，而且成功實現(xiàn)了在畢赤酵母中的活性表達。

圖5 MM-藍色葡聚糖T2000平板

2.4 SDS-PAGE電泳檢測表達產(chǎn)物

挑取表達菌株接種于30mL BMG的培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)約24h，離心收集菌體，用含1%甲醇的BMM培養(yǎng)基重懸菌體，誘導表達。不同時間取樣，發(fā)酵液上清溶于5×上樣緩沖液，SDS-PAGE檢驗結(jié)果見圖6。從圖6中可見，在66ku附近有一相應(yīng)條帶，其與天然的朱黃青霉α-1，6-葡聚糖酶理論分子量相符(67ku)，而陰性對照中沒有相應(yīng)條帶。畢赤酵母對重組蛋白的糖基化作用可能是目的蛋白分子量稍大的原因。

2.5 溫度和甲醇濃度對重組畢赤酵母表達的影響

以1%甲醇為碳源誘導重組畢赤酵母進行表達，α-1，6-葡聚糖酶活性隨時間變化曲線如圖7所示。圖7中顯示培養(yǎng)基中的α-1，6-葡聚糖酶活性在誘導120h時可達到42.51U/mL。

圖6 重組酵母的表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果注:1-P.pastoris GS115的上清;2～4-經(jīng)甲醇誘導24、72、120h的P.pastoris GS115/pPIC9K-dex上清。

圖7 重組畢赤酵母在BMM培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶曲線

溫度是影響微生物生長和表達的最為關(guān)鍵的因素之一。溫度升高，有利于微生物的生長代謝和蛋白表達，但溫度過高也會使菌體過早衰老，發(fā)酵周期縮短，降低蛋白表達量和活性。因此，必須選擇合適的溫度，而且在不同階段，應(yīng)選擇不同的溫度。圖8為誘導溫度對重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響。28℃與30℃對產(chǎn)酶的影響不大，當溫度為32℃時，目的蛋白的表達遠遠低于其他三個溫度，與文獻報道的畢赤酵母在超過32℃的情況下生長緩慢，衰退提前，已造成菌體過早死亡，表達低下［12］等相符。由于實驗室搖床溫度限制，故后續(xù)實驗溫度選擇30℃。

圖8 誘導溫度對表達外源α-1，6-葡聚糖酶的影響

培養(yǎng)基的組成特別是碳源直接影響菌體生長和誘導表達，故選擇合適的碳源及濃度也對重組畢赤酵母表達十分重要。甲醇作為外源蛋白表達的誘導劑，也是誘導過程中的碳源。在甲醇連續(xù)添加的情況下，可能造成甲醇蓄積，對菌體產(chǎn)生毒害作用，添加量不足，又會造成碳源不足，影響菌體生長。通過優(yōu)化甲醇添加濃度發(fā)現(xiàn)1.5%體積分數(shù)的甲醇添加量對α-1，6-葡聚糖酶的表達最為合適，在144h時酶活達到88.35U/mL，見圖9。

3 結(jié)論

圖9 甲醇濃度對表達外源α-1，6-葡聚糖酶的影響

α-1，6-葡聚糖酶在醫(yī)療、牙科及制糖工業(yè)中具有十分重要的應(yīng)用［13］，但目前國內(nèi)外關(guān)于α-1，6-葡聚糖酶的研究相對于其他類型的葡聚糖酶類如β-1，3-葡聚糖酶等并不深入。本研究通過PCR技術(shù)從朱黃青霉C12114菌株中成功擴增出α-1，6-葡聚糖酶基因，通過基因重組在畢赤酵母中成功表達α-1，6-葡聚糖酶基因。此外，對利用畢赤酵母誘導培養(yǎng)基BMM對α-1，6-葡聚糖酶的表達的溫度和甲醇誘導濃度進行簡單的優(yōu)化，結(jié)果表明:30℃，1.5%體積分數(shù)的甲醇添加量為α-1，6-葡聚糖酶最適表達條件，最高酶活可達到88.35U/mL。畢赤酵母作為高效表達外源蛋白的表達系統(tǒng)，可高密度發(fā)酵是其重要的優(yōu)點，今后將結(jié)合搖瓶培養(yǎng)的優(yōu)化結(jié)果指導重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-dex的發(fā)酵罐培養(yǎng)，使α-1，6-葡聚糖酶能夠高效表達。

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Expression of α-1，6-dextranase from Penicillium minioluteum in P.pastoris

ZHUANG Ling-xi1，DUAN Ran1，CHEN Long-jun2，LING Xue-ping1，LU Ying-hua1，*
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，China; 2.Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute，Guangzhou 510316，China)

α-1，6-dextranase，which can hydrolyze dextran specifically by cutting off the α-1，6-glycosidic bond to release shorter saccharides，was widely used in many fields such as sugar industry and beer industry.The gene of α-1，6-dextranase(dex)was amplified through PCR by using Penicillium minioluteum C12114 genomic DNA as template.The amplified gene was cloned into vector pPIC9K and the recombinant plasmid pPIC9K-dex was linearzed with Sac I，then transformed into P.pastoris GS115 by electroporation.The positive transformant was induced to express the enzyme with 1.5%methanol for 7 days under the 30℃，and the activity of the enzyme could reach 88.35U/mL.

α-1，6-dextranase;Penicillium minioluteum;P.pastoris;induction

TS201.3

A

1002-0306(2011)11-0194-04

α-1，6-葡聚糖(Dextran)是α-D-吡喃型葡萄糖的聚合物，主要通過α-1，6糖苷鍵連接，含有少量的α-1，2、α-1，3和α-1，4糖苷鍵。葡聚糖在醫(yī)療上可以代替血漿，控制藥物釋放;在牙科中，葡聚糖會與唾液中的糖蛋白形成牙菌斑;而在制糖工業(yè)中，腸系膜狀白念珠菌(Leuoconostoc mesenteroides)利用蔗糖合成葡聚糖，造成糖分損失，使糖汁粘度增高導致過濾困難，蔗糖的結(jié)晶效率降低，糖的精煉質(zhì)量下降等［1-2］。α-1，6-葡聚糖酶能夠切斷葡聚糖中的α-1，6-糖苷鍵，產(chǎn)生異麥芽糖或異麥芽三糖以及分子量較小的葡聚糖，使其失去親水性和粘性，提高精糖的質(zhì)量和制糖效率。真菌中的青霉菌、油脂酵母、黑曲霉以及細菌中的鏈球菌、芽孢桿菌都能產(chǎn)生α-1，6-葡聚糖酶［3］。真菌中的朱黃青霉(Penicillium minioluteum)產(chǎn)生的α-1，6-葡聚糖酶具有較高的熱穩(wěn)定性，適合運用于制糖工業(yè)中［4］。朱黃青霉來源的α-1，6-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶類的GH49類，分子大小為67ku，等電點為3.88，其最適反應(yīng)pH為5.0［5］。由于青霉菌的生長較慢，產(chǎn)物的活性和產(chǎn)量較低，提取純化不易，難以適合工業(yè)化生產(chǎn)。畢赤酵母(P.pastoris)表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng)，不僅能夠大量表達異源蛋白，而且也能對外源蛋白進行翻譯后修飾如適度糖基化、正確折疊、形成二硫鍵等，從而保持異源蛋白的生物活性［6-7］。本實驗將朱黃青霉C12114的α-1，6-葡聚糖酶基因?qū)氘叧嘟湍副磉_載體pPIC9K中構(gòu)建重組菌，研究α-1，6-葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達，以提高 α-1，6-葡聚糖酶的產(chǎn)量用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2010-11-17 *通訊聯(lián)系人

莊靈習(1986-)，女，碩士，在讀研究生，研究方向:微生物發(fā)酵。

廣東省科技計劃項目。