人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立和表型分析

劉長(zhǎng)樂(lè) ，李廣平 ，鄭心田 ，孟恒星 ，邱錄貴 ，婁建石

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科，天津300211；2.中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液病學(xué)研究所，天津300020；3.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津300070）

骨髓（bonemarrow，BM）中包含有兩類干細(xì)胞，即造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs屬混雜細(xì)胞群，其表面抗原標(biāo)志尚未完全確定。MSCs作為多能干細(xì)胞具有可塑性，有報(bào)道顯示在細(xì)胞因子作用下可以在體外誘導(dǎo)分化為骨骼肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且參與體內(nèi)組織新生、損傷修復(fù)和重建[1]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改進(jìn)的密度梯度離心法、差異貼壁法和酶消化法建立MSCs的體外培養(yǎng)擴(kuò)增模型，尋找高度特異性的表面抗原，以利于干細(xì)胞移植的廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）BM：39歲男性健康志愿者5mL。（2）儀器：FACScar流式細(xì)胞儀（Beckman-Coulter），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS），熒光顯微鏡（OLYMPUS），恒溫培養(yǎng)箱（Forma Scientific），高速低溫離心機(jī)（Beckman-Coulter），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 KX21型（SYSMEX）。（3）試劑和材料：人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破饭荆?、DMEM/F12+MCDB培養(yǎng)基（Invitrogen），F(xiàn)CS（hyclon），IGF（pepro tech），bFGF（pepro tech），EGF （pepro tech），CD34 IgG（Coulter），KDR IgG （R&D Systems），CD44 FITC（Genevale），CD45 FITC（Coulter），CD54 FITC（B&D），CD73 PE（B&D），CD90 FITC （B&D），CD105 PE（Laboratories），CD106 PE（Biole gend），IgG-FITC/PE（B&D）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的原代培養(yǎng) 抽取BM液5mL，肝素抗凝。DMEM+F12培養(yǎng)液稀釋后，用人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll（比重為1.077）密度梯度離心法，分離出單個(gè)核細(xì)胞。用DMEM+F12洗滌后，加入DMEM+F12與MCBD的混合培養(yǎng)液，并加入10%胎牛血清（FCS）、2 ng/mL bFGF、10 ng/mLEGF、10 ng/mL IGF。24 h后棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每4d半量換液，倒置相差顯微鏡每天觀察生長(zhǎng)情況，蘇木-伊紅（HE）染色觀察攝片。

1.2.2 MSCs的傳代培養(yǎng) 生長(zhǎng)12 d后近融合時(shí)，用2mL 0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液消化，以1:2～1:3傳代。每天觀察生長(zhǎng)情況。

1.2.3 表面抗原檢測(cè) 收集培養(yǎng)細(xì)胞，取1×104個(gè)細(xì)胞用PBS調(diào)整到100μL，經(jīng)多聚甲醛固定后用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè) CD34、CD45、CD54、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和KDR陽(yáng)性表達(dá)百分比。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下直接觀察細(xì)胞形態(tài) 從BM液中分離出的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)散在貼壁細(xì)胞，并伸展為長(zhǎng)梭形或多角形，即為原代MSCs（P0）。細(xì)胞呈克隆樣成簇生長(zhǎng)，初始細(xì)胞形態(tài)及大小不一。原代MSCs培養(yǎng)14 d，克隆生長(zhǎng)細(xì)胞見(jiàn)有90%融合。第4代細(xì)胞形態(tài)漸趨均一化，生長(zhǎng)速度快且倍增穩(wěn)定。見(jiàn)圖1、2。

2.2 HE染色 胞核呈藍(lán)色、卵圓形，大而不規(guī)則，可見(jiàn)核仁，胞漿呈粉紅色，胞質(zhì)均勻，胞膜較清楚。見(jiàn)圖3。

圖3 MSCs（HE，×400）

2.3 MSCs表面抗原表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:CD44++、CD73++、CD90++、CD105++；CD54+、CD106+、CD34-、CD45-、KDR-。具體數(shù)值見(jiàn)圖 4。

圖4 MSCs表面抗原表達(dá)（%）

3 討論

目前研究MSCs的生物學(xué)特性和增殖特點(diǎn)的關(guān)鍵是利用一種方法獲得更為純凈、單一的MSCs。密度梯度離心是目前應(yīng)用最多的方法，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合自然貼壁法、酶消化法分離獲得的細(xì)胞較多，而且增殖速度較快。BM單個(gè)核細(xì)胞接種24 h后有少量細(xì)胞貼壁，貼壁后分裂增殖逐漸伸展成梭形或多角形，貼壁第5天呈克隆樣簇狀生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，生長(zhǎng)速度加快。經(jīng)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增至第4代，細(xì)胞形態(tài)較為均一，生長(zhǎng)倍增穩(wěn)定。

目前鑒定MSCs的表面標(biāo)記物具有非專一性和種屬特異性，MSCs可以表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志，以及多種細(xì)胞因子、粘附分子和生長(zhǎng)因子的受體[1]。人MSCs與造血干細(xì)胞共同存在于BM中，但MSCs不表達(dá)典型造血細(xì)胞表面抗原，如造血干細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45、單核/巨噬細(xì)胞表面抗原CD14等[2]。MSCs只表達(dá) CD29、CD44、CD90、CD105、CD166 等基質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志[3]。還有報(bào)道 CD105+、CD73+、CD90+和 CD45-、CD34-、CD14-這一細(xì)胞群代表MSCs[4]。

本實(shí)驗(yàn)中CD34在MSCs中表達(dá)量極小，說(shuō)明不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志。CD45是泛白細(xì)胞標(biāo)志物，又稱白細(xì)胞共同抗原，有研究報(bào)道在用單克隆抗體磁珠分選MSCs組分時(shí)，發(fā)現(xiàn)CD45在MSCs有低水平的表達(dá)，但在人工培養(yǎng)下，很快即失去表達(dá)陽(yáng)性[4]。本實(shí)驗(yàn)第4代MSCs顯示CD45為陰性表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（kinase-insert domain contein ing receptor，KDR），主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞及胚胎內(nèi)皮的前體細(xì)胞上。目前多數(shù)BM來(lái)源的內(nèi)皮前體細(xì)胞具有某些血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，稱之為內(nèi)皮祖細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，KDR在MSCs有微量表達(dá)，這些KDR+細(xì)胞亦可能是內(nèi)皮祖細(xì)胞群，反映了MSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞可能有一定的近緣關(guān)系[5]。CD106即血管細(xì)胞黏附分子（VCAM-1），可以表達(dá)于BM基質(zhì)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)MSCs中CD106弱陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占24.85%，顯示出BM基質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)表型。CD54稱為細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)，在人體內(nèi)表達(dá)較局限，僅限于T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，某些上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)MSCs呈中等量表達(dá)CD54，表明MSCs保留BM單核細(xì)胞的某些特性。CD44為一種粘附分子，是骨橋蛋白和透明質(zhì)酸的受體，在BM的組成中起著重要作用，本實(shí)驗(yàn)CD44在MSCs表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性也證實(shí)了其表型特異性[6]。CD105，又稱轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，在BM前體細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)，是構(gòu)成細(xì)胞膜整體所必需的蛋白質(zhì)。CD73存在于淋巴細(xì)胞B和T細(xì)胞亞群、濾泡樹(shù)突細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，可能是淋巴細(xì)胞的成熟標(biāo)志。CD90同時(shí)表達(dá)于腦和淋巴組織。本實(shí)驗(yàn)此三種抗原均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與先前文獻(xiàn)有一定差異，是一個(gè)值得注意的現(xiàn)象。我們認(rèn)為 MSCs表型呈現(xiàn)：CD44++、CD73++、CD90++、CD105++；CD54+、CD106+、CD34-、CD45-的特征，表明各抗原表達(dá)差異明顯，具有一定程度特異性，也證明所獲取的MSCs純度較高。

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