嗜酸乳桿蓖生物抗性的研究

程秀云，羅玉芳

(福建華南女子職業(yè)學(xué)院，福建福州350007)

嗜酸乳桿蓖生物抗性的研究

程秀云，羅玉芳

(福建華南女子職業(yè)學(xué)院，福建福州350007)

選擇一株嗜酸乳桿菌優(yōu)良菌株為研究對(duì)象，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定嗜酸乳桿菌在各因素的作用下的存活率來(lái)研究其耐酸、耐滲透壓、耐膽鹽能力以及模擬人體腸胃環(huán)境研究胃酸、食鹽、膽鹽對(duì)嗜酸乳桿菌的綜合影響;從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出嗜酸乳桿菌具有一定的抗性能力。

嗜酸乳桿菌，耐酸能力，耐滲透壓能力，耐膽鹽能力，綜合影響

嗜酸乳桿菌是人體腸道內(nèi)的重要益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，抑制病原微生物生長(zhǎng)，緩解乳糖不耐癥，降低膽固醇和抑制腸道腹瀉等作用，被視為第三代酸乳發(fā)酵劑菌種;但嗜酸乳桿菌進(jìn)入人體腸胃環(huán)境時(shí)，腸胃的高酸、高膽鹽濃度和NaCl濃度都會(huì)影響嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)和存活，所以實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體腸胃環(huán)境，研究其存活率對(duì)人的保健作用是十分有意義的，特別是對(duì)維持胃腸道正常生理功能具有重要意義［1－2］。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

嗜酸乳桿菌 學(xué)院保存的菌株;牛奶培養(yǎng)基用脫脂乳配成13%水溶液，自然pH，115℃ 10min滅菌，用于活化嗜酸乳桿菌;MRS固體培養(yǎng)基 蛋白胨10g、酵母提取物5g、牛肉膏10g、磷酸氫二鉀2g、檸檬酸二胺 2g、乙酸鈉 5g、葡萄糖 20g、吐溫 80 1mL、MgSO4·4H2O 0.05g、瓊脂 10～15g，蒸餾水 1000mL，pH6.2～6.4，用于嗜酸乳桿菌菌落計(jì)數(shù);MRS液體培養(yǎng)基 MRS固體培養(yǎng)基成分中不加瓊脂，用于加入膽鹽作用培養(yǎng)［3－4］;1mol/L HCl 溶液、1mol/L NaOH溶液、NaCl、豬膽鹽 所用試劑均采用分析純，并根據(jù)國(guó)標(biāo)配制。

YXQ－LS－50SL型高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PYX－DHS型隔水式點(diǎn)熱恒溫培養(yǎng)箱 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;JT－5003型精密電子天平 深圳市華恒儀器有限公司;微生物實(shí)驗(yàn)常規(guī)玻璃儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌耐酸能力的測(cè)定 將牛奶培養(yǎng)基活化好的菌種10mL分別用1mol/L HCl調(diào)節(jié)其pH，使之達(dá)到 4、3、2、1，37℃ 保溫，在作用時(shí)間為 1、2、3、4h 時(shí)，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定其存活率［3，5］。

存活率(%)=鹽酸作用后的活菌數(shù)/作用前的活菌數(shù)×100%

1.2.2 嗜酸乳桿菌耐滲透壓能力的測(cè)定 在MRS固體培養(yǎng)基中加入NaCl，使其濃度分別為0.85%、2%、4%、6%。將牛奶培養(yǎng)基活化好的菌種按稀釋平板分離的方法分別接種于上述培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況，并計(jì)數(shù)［5－7］。

存活率(%)=添加不同NaCl濃度的MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)/正常MRS培養(yǎng)基中的活菌數(shù)×100%

1.2.3 嗜酸乳桿菌耐膽鹽能力的測(cè)定 在MRS液體培養(yǎng)基中加入豬膽鹽，使其濃度分別為0%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%，分別裝于三角瓶中，每瓶100mL。將牛奶培養(yǎng)基活化好的菌種以5%的接種量分別接種到上述的培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每間隔1h取出培養(yǎng)液檢測(cè)其活菌數(shù)，觀察其生長(zhǎng)情況［1－4］。

存活率(%)=培養(yǎng)后的活菌數(shù)/培養(yǎng)前的活菌數(shù)×100%

1.2.4 胃酸、食鹽、膽鹽對(duì)嗜酸乳桿菌的綜合影響實(shí)驗(yàn)(模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)) 將牛奶培養(yǎng)基活化好的菌種20mL分別用1mol/L HCl調(diào)整其pH，使之達(dá)到3、2、1，在作用時(shí)間為1、2、3h后，用1mol/L NaOH 進(jìn)行中和，并調(diào)pH到7.2～7.4左右，加1%的膽鹽，37℃保溫，在作用時(shí)間為1、2、3h后，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定其存活率［3，5－6］。

存活率(%)=綜合作用后的活菌數(shù)/作用前的活菌數(shù)×100%

表1 在不同的pH、不同的作用時(shí)間下嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)

表2 NaCl濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

表3 膽鹽對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜酸乳桿菌耐酸性實(shí)驗(yàn)

食物由口腔進(jìn)入胃后，會(huì)在胃中停留0～6h，而胃中的胃酸pH為0.9～1.5，在此期間胃酸必然會(huì)影響到嗜酸乳桿菌的存活。本實(shí)驗(yàn)用HCl模擬胃酸進(jìn)行嗜酸乳桿菌抗酸性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，a.在相同的作用時(shí)間內(nèi)，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)隨著酸度的增加而減少，存活率逐漸下降，在相同的pH下，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，存活率逐漸下降。說(shuō)明酸度對(duì)嗜酸乳桿菌生存有較大的影響。

b.在pH1(相當(dāng)于空腹時(shí)胃酸的酸度)與pH3的條件(相當(dāng)于飯后胃酸的酸度)4h內(nèi)，嗜酸乳桿菌的存活率在10%左右，即每毫升仍有106個(gè)以上的嗜酸乳桿菌存活，基本能達(dá)到其生物效應(yīng)。說(shuō)明嗜酸乳桿菌能抵御人體的胃酸的環(huán)境而存活，具有良好的耐酸能力。

2.2 嗜酸乳桿菌耐鹽實(shí)驗(yàn)

一般情況下酸奶都在飯后食用，胃中的食物一般都含有一定濃度的食鹽，而嗜酸乳桿菌正常生長(zhǎng)不需要添加NaCl，所以食鹽是否會(huì)影響嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)是值得重視的問(wèn)題。用加入不同濃度的NaCl的MRS培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)嗜酸乳桿菌，看看嗜酸乳桿菌能耐受多大濃度的NaCl，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，a.隨著NaCl濃度的增加，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)逐漸減少，存活率呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明NaCl的濃度影響嗜酸乳桿菌的存活。b.在NaCl濃度為2%的MRS培養(yǎng)基中有78%的嗜酸乳桿菌可以正常生長(zhǎng)，說(shuō)明在正常飲食過(guò)程中食物中的NaCl濃度基本不影響嗜酸乳桿菌的存活率。

2.3 嗜酸乳桿菌耐膽鹽能力的測(cè)定

膽鹽是膽汁的主要成分之一，成年人每日分泌膽汁約800～1000mL至十二指腸中，在正常飲食條件下，膽汁鹽濃度為0.9%～1.5%，膽鹽能對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)起抑制作用，嗜酸乳桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，要發(fā)揮其生理功效，需要通過(guò)含高膽汁酸鹽的十二指腸到達(dá)腸道的下部，因此菌株應(yīng)該具有抗膽鹽特性，才能為其在腸道中發(fā)揮健康作用打下基礎(chǔ)。

經(jīng)牛奶培養(yǎng)基活化的菌種每毫升嗜酸乳桿菌數(shù)達(dá)1.3×108cfu/mL，以5%的接種量接種到100mL含不同濃度膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基中嗜酸乳桿菌起始數(shù)達(dá)4.8×106cfu/mL，經(jīng)過(guò)37℃恒溫培養(yǎng)，每間隔1h取出培養(yǎng)液檢測(cè)其活菌數(shù)，觀察其生長(zhǎng)情況。結(jié)果如表3所示。

由表3可知，a.低濃度(0.1%)的膽鹽不影響嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng);當(dāng)膽汁鹽濃度≥0.5%時(shí)，隨著膽汁鹽濃度增大，培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)逐漸減少，說(shuō)明一定濃度的膽鹽對(duì)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用。b.在正常的飲食條件下，人體小腸的膽汁鹽濃度為0.9%～1.5%，嗜酸乳桿菌在這種的環(huán)境下比較難生長(zhǎng)繁殖，但在高濃度的膽鹽條件4h后仍有0.2%左右的嗜酸乳桿菌存活，說(shuō)明在飲食過(guò)程中仍有少部分嗜酸乳桿菌可以到達(dá)大腸而定殖，從而改善大腸中的菌系;所以建議每天飲用嗜酸乳桿菌飲料以增加腸道中的乳酸菌菌群數(shù)。

2.4 胃酸、食鹽、膽鹽對(duì)嗜酸乳桿菌的綜合影響

酸奶攝入后首先受到胃中胃酸、食物中的NaCl綜合影響，經(jīng)胃排空后進(jìn)入十二指腸被小腸液中和想的培養(yǎng)條件為:pH7.5，37℃條件下培養(yǎng)，裝液量為的同時(shí)也受到膽鹽的作用，這幾方面的綜合作用是否加大對(duì)嗜酸乳桿菌的存活率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 嗜酸乳桿菌在胃酸、NaCl、膽鹽綜合作用下的活菌數(shù)(cfu/mL)

從表4可以看出，a.胃酸、NaCl、膽鹽共同作用后對(duì)嗜酸乳桿菌的存活率影響很大，在強(qiáng)胃酸(pH1)和正常膽鹽濃度的作用下，嗜酸乳桿菌的存活數(shù)僅達(dá)到十萬(wàn)分之一，所以空腹時(shí)(胃酸pH在2以下)飲用酸奶，能到達(dá)大腸的嗜酸乳桿菌數(shù)量?jī)H剩攝入量的十萬(wàn)分之一(假設(shè)胃排空時(shí)間為1h左右，小腸中停留時(shí)間為3h)。b.若在飯后食用酸奶，因食物的中和作用使胃酸pH可達(dá)3～5，假設(shè)飯后1h飲用酸奶，胃排空約3h(即胃酸作用3h)，在小腸停留時(shí)間3h(即膽鹽作用3h)，此時(shí)到達(dá)大腸的乳酸菌數(shù)每毫升可達(dá)103個(gè)，若飯后2h飲用則每毫升可達(dá)104個(gè)。c.綜上所述，乳酸菌飲料在早點(diǎn)或午點(diǎn)加餐時(shí)飲用較適合，若一次飲用250mL，大約有十萬(wàn)個(gè)左右活的乳酸菌到達(dá)大腸而定殖。

3 結(jié)論

嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)受酸度和膽鹽濃度增加而受到抑制，正常的飲食過(guò)程中，NaCl濃度基本上不會(huì)影響其生長(zhǎng)，胃酸、食鹽、膽鹽對(duì)嗜酸乳桿菌的綜合作用對(duì)嗜酸乳桿菌存活率的影響較大。所以一方面選擇具有良好耐酸、耐滲透壓、耐膽鹽能力的菌種來(lái)生產(chǎn)酸奶從而提高存活率是十分有必要的;另一方面可以選擇在較適宜的時(shí)間食用，增加嗜酸乳桿菌在大腸內(nèi)定殖量，改善大腸中的菌系。

［1］肖仔君，陳惠音，楊汝德.嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.廣州食品工業(yè)科技，2003，19(B11):90－92.

［2］呂兵，張國(guó)農(nóng)，楊瑞歡.嗜酸乳桿菌生物特性及其發(fā)酵乳的研究［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2002，30(5):37－39.

［3］張帆，王建華，劉立恒，等.嗜酸性桿菌的培養(yǎng)條件及其生物學(xué)特性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(3):43－47.

［4］王天云，陳振風(fēng)，王福源.嗜酸乳桿菌在不同pH條件下生長(zhǎng)和存活情況的研究［J］.工業(yè)微生物，2000，30(3):12－15.

［5］趙瑞香，孫俊良，李元瑞，等.嗜酸乳桿菌抗酸抗膽汁鹽能力的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32(2):57－60.

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Study on the biological resistance of Lactobacillus acidophilus

CHENG Xiu－yun，LUO Yu－fang
(Fujian Huanan Women’s College，F(xiàn)uzhou 350007，China)

A fine strain of Lactobacillus acidophilus was selected as the research object.It measured the method of plate culture count to confirm the survival of Lactobacillus acidophilus under different factors to study its acid－resistant，osmotic pressure tolerance，salt and bile tolerance and to study the comprehensive influences of gastric acid，salt and bile on Lactobacillus acidophilus by simulating of human gastrointestinal environment.Finally it concluded that Lactobacillus acidophilus had a certain resistance capacity.

Lactobacillus acidophilus;acid－resistant;osmotic pressure tolerance;salt and bile tolerance;comprehensive influence

TS201.1

A

1002－0306(2011)06－0232－03

2009－07－31

程秀云(1970－)，女，碩士，講師，研究方向:微生物應(yīng)用。