直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)豬肉中的沙丁胺醇

郭柏雪，生 威，余桂春，石 曼，鄧 捷，陳文潔，王 碩

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)豬肉中的沙丁胺醇

郭柏雪，生 威，余桂春，石 曼，鄧 捷，陳文潔，王 碩*

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

建立了一種用于檢測(cè)沙丁胺醇的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法，方法靈敏度(IC50)為0.80μg/L，檢測(cè)限(IC15)為0.06μg/L，檢測(cè)的線性范圍0.06～20.00μg/L。與克倫特羅的交叉反應(yīng)率為100%，與特布他林的交叉反應(yīng)率為10.5%，與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物并無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，因此可以采用本實(shí)驗(yàn)建立的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法同時(shí)測(cè)定食品中的沙丁胺醇和克倫特羅。本實(shí)驗(yàn)的樣品處理方法簡(jiǎn)便，豬肉樣品中的檢測(cè)限為0.6μg/kg，添加三個(gè)濃度的樣品，其添加回收率均在85%～100%之間，RSD值小于5.51%。

沙丁胺醇，抗體，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，豬肉

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)屬于β－興奮劑類(lèi)藥物。近些年來(lái)由于頻發(fā)因食用含克倫特羅殘留的動(dòng)物性食品而導(dǎo)致的食物中毒事件，使得各國(guó)政府都加強(qiáng)了對(duì)傳統(tǒng)瘦肉精克倫特羅非法使用的監(jiān)督檢測(cè)力度，一些非法商販為了牟取暴利，開(kāi)始尋找新的替代品。由于沙丁胺醇促生長(zhǎng)作用與克倫特羅類(lèi)似，體內(nèi)代謝時(shí)間又比克倫特羅短、毒副作用也相對(duì)較弱，于是沙丁胺醇繼克倫特羅之后，成為飼料中營(yíng)養(yǎng)再分配劑的首選品。當(dāng)然，這對(duì)于廣大的消費(fèi)者來(lái)說(shuō)存在著巨大的危害，人食用過(guò)量的含較高濃度的沙丁胺醇的動(dòng)物組織后，會(huì)出現(xiàn)肌肉顫動(dòng)、頭痛、暈眩、肌痛、神經(jīng)過(guò)敏、心悸、心動(dòng)過(guò)速、甚至惡心、嘔吐等中毒癥狀［1］，特別是對(duì)患有心臟缺陷病和懷孕晚期的人群具有威脅的可能性更大［2］。因此目前包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都已將該類(lèi)藥物禁用。早在2002年我國(guó)農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部就公布沙丁胺醇屬于6種禁用β－興奮劑類(lèi)獸藥之一，并且在肉品中的限量要求為不得檢出，即含量≤0.1μg/kg［3］。因此，建立科學(xué)、高效、簡(jiǎn)便的藥殘監(jiān)控方法十分必要。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SAL殘留檢測(cè)主要采用儀器分析方法，其優(yōu)點(diǎn)是精確度高、假陽(yáng)性率低;但是這類(lèi)方法檢測(cè)過(guò)程繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、儀器昂貴、操作復(fù)雜，不便于現(xiàn)場(chǎng)大量樣品的檢測(cè)。而酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易操作、方便快捷、成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，是目前快速有效檢測(cè)此類(lèi)藥物較普遍的篩選方法［4－5］。本實(shí)驗(yàn)建立了檢測(cè)沙丁胺醇的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，相比常用的間接ELISA方法［6］，其檢測(cè)時(shí)間更短，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)SAL的試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙丁胺醇、特布他林、異丙腎上腺素、萊克多巴胺、多巴酚丁胺標(biāo)準(zhǔn)品、福氏佐劑、牛血清白蛋白(BSA)、3，3，5，5－四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 美國(guó) Sigma公司;包被緩沖液 0.05mol/L碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6;磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4) Na2HPO4·12H2O 13.76g，NaH2PO41.38g，NaCl 5g，加雙蒸水至1000m L，調(diào)節(jié)pH至7.4;洗滌液(PBST，pH7.4)

5m L 10%吐溫－20溶于1000m L PBS;底物液(TMB－過(guò)氧化氫脲溶液) 底物液A:取無(wú)水醋酸鈉8.2g，β－糊精 2.5g，過(guò)氧化氫脲 428.6mg，加雙蒸水至1000m L，調(diào)節(jié)pH至5.0，4℃保存，使用時(shí)需恢復(fù)至室溫，底物液B:取100mg TMB溶于10m L DMSO中，棕色瓶保存，使用前15m in混合:14.6m L A溶液和0.45m L B溶液;終止液:1.25mol/L的H2SO4溶液;封閉液1.0%BSA/PBS溶液;免疫動(dòng)物 雄性新西蘭大白兔，12～16 周齡，體重1.5～2kg。

96孔酶標(biāo)板 丹麥NUNC公司;蛋白純化儀美國(guó)BIO－RAD公司;酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;微量可調(diào)移液器 法國(guó)GILSON公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備沙丁胺醇抗體及其濃度測(cè)定

1.2.1.1 免疫程序 選取月齡3個(gè)月左右，體重1.5～2kg的雄性新西蘭大白兔，確定身體狀況正常后進(jìn)行免疫。采取多點(diǎn)皮下注射法進(jìn)行免疫。初次免疫人工抗原的量為1mg/只，人工抗原與弗氏佐劑以1∶1比例進(jìn)行乳化;分別于初次免疫后2、4、6、12周加強(qiáng)免疫四次，分別于第二、三、四、五次免疫完后8～10d，由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行抗血清效價(jià)和特異性測(cè)定。五次免疫后采用股動(dòng)脈采血法采集全血。4℃進(jìn)行離心，收集全部血清。

1.2.1.2 抗體的純化和濃度測(cè)定 采用Protein ASephaorse 4B親和層析法純化抗體。純化后的抗體用PBS稀釋20倍，在λ=280nm處測(cè)吸光度值，以PBS為空白對(duì)照，計(jì)算出抗體濃度。

1.2.2 豬肉樣品的處理 本實(shí)驗(yàn)選取零售的精瘦豬肉作為樣品，稱(chēng)取2g豬肉，均質(zhì)后置于50mL塑料離心管中，先加入2mL 0.1mol/L的HC1溶液，超聲10min，再加入8m L PBS渦旋混合5m in，4℃(4500 r/m in)離心10m in，取上層清液用1mol/L NaOH將pH調(diào)為7.4(若有沉淀則需再離心)，將上清液用PBS稀釋后用于ELISA測(cè)定。

1.2.3 直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的檢測(cè)步驟 a.包被抗體:用包被液稀釋抗體，在酶標(biāo)板上加入抗體溶液(100μL/孔)，于4℃下包被過(guò)夜。然后棄去孔中液體，并用PBST洗液洗板3次。b.封閉:37℃，用封閉液(200μL/孔)封閉1h，棄封閉液并用 PBST洗液洗板3次。c.加酶標(biāo)抗原:每孔先加入50μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品提取液(均溶于PBS中)，然后加入50μL酶標(biāo)抗原溶液(酶標(biāo)抗原溶于PBS中)，室溫孵育1h，然后用PBST洗液洗板3次。d.顯色:在每個(gè)孔中加入100μL底物液，于37℃下反應(yīng)15m in。e.終止反應(yīng):每孔添加50μL的終止液，終止反應(yīng)。f.讀取OD值:在雙波長(zhǎng)方式(450～650nm)下用酶標(biāo)儀讀取OD值。根據(jù)吸光度值計(jì)算抑制率，如式(1)。

式中:IC%－沙丁胺醇對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率;A對(duì)照－只添加酶標(biāo)及標(biāo)樣稀釋液的吸光度值;A樣品－沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值;A空白－不加入酶標(biāo)及沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線:以抑制率為縱坐標(biāo)Y軸，沙丁胺醇濃度對(duì)數(shù)值為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，是典型S型曲線。

1.2.3.2 包被抗體和酶標(biāo)抗原濃度的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用棋盤(pán)滴定法對(duì)抗體包被量和酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。用包被液稀釋抗體，抗體稀釋倍數(shù)分別為100、200、400、800、1600 倍，包被和封閉后，加入不同濃度的酶標(biāo)抗原(溶于PBS中)，酶標(biāo)抗原的稀釋倍數(shù)分別為 200、400、800、1600、3200、6400、12800倍，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇吸光值在1.0左右，靈敏度最好的抗體包被量和酶標(biāo)抗原濃度作為最佳工作條件。

1.2.3.3 封閉液的選擇以及濃度優(yōu)化 按照優(yōu)化工作條件，用0.5%、1.0%的脫脂乳粉和0.5%、1.0%、1.5%的BSA溶液作為封閉液，綜合考慮靈敏度和吸光值兩個(gè)因素，確定最佳工作條件。其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 沙丁胺醇直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在優(yōu)化的工作條件下，將沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成不同濃度，以直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，得到不同濃度的沙丁胺醇在450～650nm時(shí)的吸光度值，根據(jù)吸光度值計(jì)算抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)Y軸，沙丁胺醇濃度對(duì)數(shù)值為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，是典型的S型曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到:抑制率為50%時(shí)的SAL濃度(IC50)即靈敏度，抑制率為15%時(shí)的SAL濃度(IC15)即檢測(cè)限。

1.2.3.5 沙丁胺醇抗體特異性的測(cè)定 為了測(cè)定抗體特異性，實(shí)驗(yàn)選擇鹽酸克倫特羅(clenbuterol，CLB)，萊克多巴胺(ractopamine，RAC)、特布他林(terbutaLine，TER)、異丙腎上腺素(isoproterenoL，ISOP)、多巴酚丁胺(dobutam ine，DOB)五種 SAL結(jié)構(gòu)類(lèi)似物進(jìn)行抗體交叉反應(yīng)。以SAL的50%抑制濃度(IC50)與競(jìng)爭(zhēng)物的50%抑制濃度之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率(CR)。交叉反應(yīng)率越小，則方法特異性越高。

交叉反應(yīng)率(%)=IC50(沙丁胺醇)/IC50(其他藥物)×100% 式(2)1.2.3.6 樣品基質(zhì)影響的消除 將豬肉樣品按照1.2.2方法處理后所得的上清液，用PBS分別進(jìn)行0倍、2倍、5倍、20倍、40倍稀釋?zhuān)缓蠓謩e繪制基質(zhì)曲線，選擇出與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本吻合時(shí)的稀釋倍數(shù)，作為最終稀釋倍數(shù)。

1.2.3.7 添加回收實(shí)驗(yàn) 取豬肉空白樣品若干份，分別添加不同濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為7、24、50μg/kg，按照 1.2.2 的樣品處理方法，提取后用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)，計(jì)算沙丁胺醇的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

抗體經(jīng)純化后，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)得抗體蛋白的濃度為1.31g/L。經(jīng)過(guò)優(yōu)化確定最佳工作條件為:包被抗體稀釋度為1∶800;酶標(biāo)抗原稀釋度為1∶1600;1.0%BSA作為封閉液。按1.2.3.1的方法操作，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為典型的S型曲線，見(jiàn)圖1。如圖可知，SAL直接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法的靈敏度，即IC50=0.80±0.10μg/L;檢測(cè)限，即 IC15=0.06 ±0.016μg/L。

圖1 沙丁胺醇直接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 沙丁胺醇抗體特異性

為了測(cè)定抗體特異性，研究了SAL抗體對(duì)5種SAL結(jié)構(gòu)相似的β－興奮劑之間的交叉反應(yīng)(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明，沙丁胺醇SAL與鹽酸克倫特羅CLB的交叉率高達(dá)100%，與特布他林TER的交叉率為10.50%，與其他的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物基本無(wú)交叉，因此可以應(yīng)用本方法同時(shí)檢測(cè)SAL和CLB。

表1 SAL抗體與結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)(n=3)

2.3 樣品基質(zhì)影響的消除

將豬肉樣品按照1.2.2方法處理后所得的上清液，用PBS分別進(jìn)行0倍、2倍、5倍、20倍、40倍稀釋?zhuān)缓蠓謩e繪制基質(zhì)曲線，對(duì)比與標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合度，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，豬肉樣品未經(jīng)稀釋的上清液的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線不能重合，說(shuō)明基質(zhì)影響沒(méi)有消除;而上清液經(jīng)過(guò)2倍稀釋之后的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線均基本吻合，說(shuō)明基質(zhì)影響基本消除。因此豬肉樣品提取上清液經(jīng)2倍稀釋后可以直接用于ELISA檢測(cè)。本方法豬肉樣品中的檢測(cè)限為0.6μg/kg。

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取豬肉樣品若干份，進(jìn)行回收率測(cè)定并計(jì)算RSD(Relative Standard Deviation)值，結(jié)果見(jiàn)表2。添加濃度分別為7、24、50μg/kg，經(jīng)1.2.2 的方法處理豬肉樣品，按照優(yōu)化后的工作濃度進(jìn)行檢測(cè)，其回收率在85%～100%之間，且RSD小于5.51%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA有較好的準(zhǔn)確性，可以用于豬肉樣品中沙丁胺醇的檢測(cè)。

圖2 豬肉樣品基質(zhì)影響－抑制率曲線

表2 添加回收實(shí)驗(yàn)(n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備了沙丁胺醇多克隆抗體，建立了一種用于檢測(cè)沙丁胺醇的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，方法靈敏度(IC50)為 0.80μg/L，檢測(cè)限(IC15)為 0.06μg/L，檢測(cè)的線性范圍為0.06～20.00μg/L。抗體與克倫特羅的交叉反應(yīng)率為100%，因此可以用本方法同時(shí)測(cè)定食品中的沙丁胺醇和克倫特羅。對(duì)添加三個(gè)濃度沙丁胺醇的豬肉樣品應(yīng)用本方法進(jìn)行檢測(cè)，其添加回收率在85%～100%之間，RSD值小于5.51%。方法在豬肉樣品中的檢測(cè)限為0.6μg/kg。本實(shí)驗(yàn)建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，方法靈敏度高，樣品處理方法簡(jiǎn)單，為獸藥殘留檢測(cè)試劑盒的研究提供了借鑒。

今后，在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上可進(jìn)行其他免疫檢測(cè)方法的研究，如免疫傳感器等，以建立更為靈敏快速的沙丁胺醇免疫分析檢測(cè)方法。雖然ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)出的陽(yáng)性結(jié)果的準(zhǔn)確性無(wú)法與 CG、HPLC、GC/MS方法相比，但是由于其快速靈敏的特性，在大批量樣品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)時(shí)常被應(yīng)用于樣品的粗篩，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，發(fā)展前景良好。初篩后檢測(cè)出的陽(yáng)性結(jié)果需要用其他方法(GC、HPLC、GC/MS等)進(jìn)行進(jìn)一步確證。

［1］邱陽(yáng)生，楊根海.沙丁胺醇單克隆抗體的制備及其鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，32(10):25－26.

［2］Shi－ Yuan Sheu，Yi－ Chih Lei，Yung－ Te Tai.Screening of salbutamol residues in swinemeat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan［J］.Analytica Chimica Acta，2009，654:148－153.

［3］邱陽(yáng)生，楊根海，何方洋.β2－興奮劑沙丁胺醇及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［D］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［4］Hasmukh B Sheth Spoms.Development of a single ELISA for Detection of Sulfonamides［J］.Agric Food Chem，1991，39:1696－1700.

［5］Brady MSKat Z SE.Antibiotic and antimicrobial residues in milk［J］.Food Prot，1988，511:8－11.

［6］孫新海，凌紅麗，王雷.沙丁胺醇?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26(12):44－47.

Determ ination of salbutamol residue in pig muscle by direct com petitive enzyme－linked immunosorbent assay

GUO Bai－xue，SHENG W ei，YU Gui－chun，SHIM an，DENG Jie，CHEN W en－jie，WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457，China)

A direct com petitive enzyme－linked immunosorbent assays(cd－ELISA)was developed for detection of salbutam ol in pork using polyclonal antibody.The sensitivity(IC50)and lim it of detection(IC15)of assay were0.80μg/L and 0.06μg/L，respectively.The ELISA detection system had the linear detection of 0.06～20.00μg/L.All of the test com pounds，except clenbutarol(100%)and terbutaline(10.5%)，showed low cross－ reactivity.Then this direct competitive ELISA could potentially be applied to the determ ination of salbutamol and clenbutarol.The lim it of detection of this developed ELISA for salbutamol in pork was0.6μg/kg.The average recoverieswere in ranges of85%～100%and RSD were below 5.51%.

salbutamol;antibody;dc－ELISA;pork

TS207.3

A

1002－0306(2011)06－0388－03

2010－01－20 *通訊聯(lián)系人

郭柏雪(1985－)，女，碩士，研究方向:營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

“十一五”科技支撐課題計(jì)劃資助項(xiàng)目(2009BADB9B06)。