蘆丁鉻的合成及其輔助降血糖作用觀察

黃建東，王建中，*，孟阿會(huì)，趙 珊，劉潔媛，陳思玉，馬國(guó)剛

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083;2.山西運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000)

蘆丁鉻的合成及其輔助降血糖作用觀察

黃建東1，王建中1，*，孟阿會(huì)1，趙 珊1，劉潔媛1，陳思玉1，馬國(guó)剛2

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083;2.山西運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000)

通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了蘆丁鉻的合成工藝，得到的最佳工藝參數(shù)為:蘆丁溶于無水乙醇后加入無水碳酸鈉反應(yīng)80min，加入三氯化鉻繼續(xù)反應(yīng)240min，溫度70℃，攪拌速度2100r/min。采用紅外光譜驗(yàn)證了有蘆丁鉻生成，X－衍射光譜法對(duì)合成的蘆丁鉻進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含有大量NaCl，然后進(jìn)行了純化，經(jīng)電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP－AES)測(cè)鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可知，純化后蘆丁鉻純度提高了6倍以上。ICP－AES法測(cè)得鉻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆丁鉻對(duì)鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)的Wistar大鼠高血糖模型有一定的輔助降血糖作用。

蘆丁鉻，合成，檢測(cè)，降血糖

蘆丁(Rutin)又名蕓香苷、維生素P、紫槲皮苷，3，3′，4′，5，7－5 羥基黃酮－3－蕓香糖苷，為一種來源很廣的黃酮類化合物，具有抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化等多項(xiàng)藥理作用，在醫(yī)藥和保健食品行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用［1］。鉻是生命必需的微量元素之一，有兩種氧化狀態(tài)，Cr6+對(duì)人體有害，而Cr3+為人體所必需。Cr3+的作用主要是維持機(jī)體正常的糖代謝及脂類代謝，缺乏時(shí)會(huì)發(fā)生兩種物質(zhì)的代謝紊亂，形成高血脂癥、糖尿病、動(dòng)脈硬化性心腦血管等疾?。?］。蘆丁和無機(jī)鉻均不易被人體吸收。研究表明，如果將蘆丁與三價(jià)鉻離子合成蘆丁鉻配合物，使有機(jī)分子蘆丁成為金屬離子Cr3+的載體，金屬離子Cr3+作為有機(jī)分子蘆丁的導(dǎo)向物;兩者匹配不僅能使其具有蘆丁軟化、擴(kuò)張血管，使微循環(huán)正常、降血脂、保肝等藥理活性，而且還能兼具三價(jià)鉻離子的藥用價(jià)值［3］。實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了蘆丁鉻合成工藝，利用紅外、原子發(fā)射、X－衍射等方法對(duì)合成的蘆丁鉻進(jìn)行了檢測(cè)，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其輔助降血糖功能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇 北京化工廠;蘆丁 含量95%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水碳酸鈉 含量99.8%，北京化工廠;三氯化鉻(含量99%)、羧甲基纖維素鈉(含鈉6.5%～8.5%) 天津市津科精細(xì)化工研究所;鏈脲霉素(STZ) Sigma公司，1g/瓶;羅格列酮馬來酸鹽 北京高盟燕山科技有限公司;GLUCOCARDⅡ型血糖試紙 日本ARKRAY Factory;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料 北京華阜康生物科技股份有限公司;大鼠1022 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所;W istar大鼠

SPF級(jí)，合格號(hào):SCXK－(軍)，雄性50只，體重140～180g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，以全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

JB－5定時(shí)雙向電子(數(shù)顯)恒溫磁力攪拌器江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;SHB－III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司;紫外光譜儀

型號(hào):UV－2550 UV－VIS Spectrophotometer，島津公司;紅外光譜儀 型號(hào):Spectrum 100 FT－IR Spectrometer，美國(guó)PerkinElmer(珀金埃爾默)公司;電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀 型號(hào):Vista－MPX CCD Simultaneous ICP－OES，美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司;X射線衍射儀 型號(hào):D8ADVANCE，德國(guó)BrukerAXS(布魯克)有限公司;600兆脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀 型號(hào):JOEL JNM－ECA600，日本電子(JEOL);日本京都血糖儀 型號(hào):GT－1640，日本ARKRAY Factory。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁鉻的合成及工藝優(yōu)化 馬國(guó)剛［3］等研究得出的蘆丁鉻合成工藝為:稱取326.6mg的槐米蘆丁放入250m L三角燒瓶中，加入25m L無水乙醇，加熱攪拌溶解，得黃色澄清溶液;向該溶液中加入128.7mg的無水碳酸鈉，繼續(xù)攪拌約1h直到有黃色蘆丁鈉鹽生成;然后稱取165.6mg三氯化鉻(CrCl3)加入溶液中，攪拌回流4h，待黃色沉淀析出，停止反應(yīng);抽濾并用約10m L無水乙醇洗滌，干燥即得成品。通過設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)對(duì)上述工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.2 蘆丁鉻的檢測(cè) 采用紫外光譜、紅外光譜、原子發(fā)射光譜、X－衍射、核磁共振等方法對(duì)合成的蘆丁鉻進(jìn)行分析檢測(cè)。1.2.3 蘆丁鉻的純化 為除去產(chǎn)品中的水溶性雜質(zhì)，將制得的產(chǎn)品置于蒸餾水中，攪拌2h，抽濾，干燥得到純度較高的蘆丁鉻。1.2.4 蘆丁鉻的輔助降血糖功能研究1.2.4.1 劑量設(shè)計(jì)及樣品配制 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，關(guān)于人體鉻的攝入量目前還沒有統(tǒng)一的說法，本實(shí)驗(yàn)參照劉煒春［4］等人研究蘆丁鉻對(duì)大鼠血脂調(diào)節(jié)作用時(shí)的劑量設(shè)計(jì)了給藥量:大劑量為78mg/kg，小劑量為7.8mg/kg。羅格列酮馬來酸鹽的給藥量為0.4mg/kg。

1.2.4.2 降低空腹血糖實(shí)驗(yàn) 大鼠禁食24h后，腹腔注射STZ(60mg/kg);自由進(jìn)食12h后，禁食不禁水12h，再腹腔注射一次STZ(60mg/kg)。一周后測(cè)血糖，血糖值在10mmol/L以上為高血糖模型成功動(dòng)物。選高血糖模型成功動(dòng)物40只，隨機(jī)分為一個(gè)模型對(duì)照組、一個(gè)陽性對(duì)照組和兩個(gè)劑量組(組間差不大于1.1mmol/L)。各組均空腹12h后給藥，劑量組給予不同濃度的蘆丁鉻，模型對(duì)照組給予溶劑(5%的CMC溶液)，陽性對(duì)照組給予羅格列酮馬來酸鹽，灌胃量5m L/kg，連續(xù)30d。實(shí)驗(yàn)中每周測(cè)體重和血糖各一次，測(cè)前空腹 12h［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁鉻工藝優(yōu)化結(jié)果

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)可知，影響蘆丁鉻合成因素顯著性順序?yàn)?A>B>D>C。最佳工藝參數(shù)為:時(shí)間1為80min，時(shí)間2為240m in，反應(yīng)溫度為70℃，攪拌速度為2100 r/m in;在此參數(shù)條件下，按下述工藝可以得到411.4mg蘆丁鉻。

為便于操作及為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備較多的蘆丁鉻，將文獻(xiàn)所述工藝參數(shù)按比例放大，因此得到的工藝路線為:稱取蘆丁34.9768g(0.05mol)放入3L的三口燒瓶中，加入3L無水乙醇，加熱攪拌溶解直到蘆丁完全溶于乙醇中(30min左右)，得到黃色澄清溶液，再稱取無水碳酸鈉10.6202g(0.1mol)，加入該溶液后，繼續(xù)加熱攪拌反應(yīng)80m in直到黃色蘆丁鈉鹽生成，然后加入三氯化鉻26.9142g(0.1mol)，繼續(xù)加熱攪拌反應(yīng)約240min，待黃色沉淀生成，停止反應(yīng)，抽濾并用250m L無水乙醇洗滌，烘干，即得成品。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2 蘆丁鉻檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 蘆丁鉻的純化 原工藝合成的產(chǎn)品，用原子發(fā)射光譜法測(cè)得鉻含量為0.6%，X－衍射法測(cè)得結(jié)果顯示產(chǎn)品中含有大量NaCl。純化后的蘆丁鉻用原子發(fā)射光譜法測(cè)得鉻的含量為3.8%，與原工藝得到的產(chǎn)品相比，純度提高6倍以上。

2.2.2 檢測(cè)結(jié)果 由于蘆丁鉻溶解度很低沒找到合適的溶劑，用紫外光譜、核磁共振法檢測(cè)后沒有得到吸收峰。紅外光譜、X－衍射法檢測(cè)結(jié)果表明生成了穩(wěn)定的蘆丁鉻。

2.2.2.1 X－衍射法檢測(cè)結(jié) 蘆丁和蘆丁鉻的X－衍射法分析圖見圖1、圖2。由圖可知，蘆丁有較好的衍射峰，而絡(luò)合了鉻以后，原來的晶態(tài)結(jié)構(gòu)變?yōu)榉蔷B(tài)結(jié)構(gòu)，衍射峰變得不明顯了?？梢姡t的絡(luò)合改變了蘆丁本來的晶體結(jié)構(gòu)，證明形成了穩(wěn)定的配合物。

圖1 蘆丁的X－衍射法分析圖

圖2 蘆丁鉻的X－衍射法分析圖

2.2.2.2 紅外光譜檢測(cè)結(jié)果 蘆丁和蘆丁鉻的紅外光譜圖見圖3、圖4。圖中顯示了各個(gè)官能團(tuán)的特征頻率，根據(jù)文獻(xiàn)資料，查得主要官能團(tuán)的紅外吸收頻率的歸屬情況如表3所示。

圖3 蘆丁的紅外光譜圖

蘆丁在3428cm－1處出現(xiàn)峰為羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰，在2936cm－1處出現(xiàn)的峰為甲基(－CH3)的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1656cm－1處出現(xiàn)了羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰，在 1456.58、1504.61、1599.20cm－1出現(xiàn)了有苯環(huán)的 伸 縮 振 動(dòng) 吸 收 峰，在 1203.33、1234.60、1295.06cm－1處分別出現(xiàn)了酚C－0鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，在878.88cm－1出現(xiàn)了芳香間取代中間孤立芳的H。

圖4 蘆丁鉻的紅外光譜圖

表3 主要官能團(tuán)的紅外吸收頻率

蘆丁鉻的紅外光譜圖與蘆丁的紅外光譜圖相比，各個(gè)官能團(tuán)的吸收峰有所位移，羥基由于絡(luò)合作用導(dǎo)致其吸收峰減弱，在3380.28cm－1處有吸收峰:甲基吸收峰沒有明顯位移，蘆丁鉻沒有羰基的吸收峰，說明羰基由于絡(luò)合作用被解開，在1476cm－1處有苯環(huán)的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1271cm－1處有C－O的伸縮振動(dòng)吸收峰;而且在473.39cm－1處出現(xiàn)了Cr－O的伸縮振動(dòng)吸收峰，說明蘆丁鉻中絡(luò)合了Cr元素。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表4，用SPSS軟件分析得出結(jié)果如表5、表6所示。

對(duì)大鼠體重影響:經(jīng)口灌胃30d后，測(cè)得的結(jié)果中，陽性藥組及蘆丁鉻大小劑量組與對(duì)照組相比較均無顯著性差異(P>0.05)。

表4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

對(duì)大鼠空腹血糖的影響:經(jīng)口灌胃30d后，蘆丁鉻大小劑量組與對(duì)照組相比較有顯著性差異(P＜0.05)，陽性藥組與對(duì)照組相比較有顯著性差異(P＜0.05)，蘆丁鉻大小劑量組相比較無顯著性差異(P>0.05)，蘆丁鉻大小劑量組與陽性藥組相比較無顯著性差異(P>0.05)。

表5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體重分析多重比較表

表6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)血糖值分析多重比較表

3 討論

隨著社會(huì)的進(jìn)步和生活方式的改變及人口的老齡化，糖尿病的患病率正呈全球性增長(zhǎng)。在我國(guó)，城鄉(xiāng)居民糖尿病的發(fā)病率正在逐年增加，已成為繼腫瘤和心血管病之后位居第三位的慢性非傳染病。糖尿病是一種終身疾病，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量，并給社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。研究能夠預(yù)防糖尿病的保健食品顯得尤為重要。理論上，蘆丁和鉻絡(luò)合以后能夠促進(jìn)人體對(duì)蘆丁和鉻的吸收，從而預(yù)防由于鉻缺乏引起的糖尿病，同時(shí)能夠起到蘆丁的軟化血管等作用。本研究?jī)?yōu)化了蘆丁鉻的合成工藝，并進(jìn)行了初步的純化，與原工藝所得產(chǎn)品相比，純度提高了6倍以上。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明蘆丁鉻可以降低高血糖動(dòng)物模型的血糖值，但是具體劑量與降血糖作用之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

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Synthesis of rutin and chrome and its auxiliary function of the blood sugar reduction

HUANG Jian－dong1，WANG Jian－zhong1，MENG A－h(huán)ui1，ZHAO Shan1，LIU Jie－yuan1，CHEN Si－yu1，MA Guo－gang2
(1.College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China;2.Department of Life Sciences，Shanxi Yuncheng University，Yuncheng 044000，China)

The optimum process parameterswere added anhydrous sodium carbonate，after rutin dissolved in ethanol，after 80m in added chrom ium chloride，The reaction time was 240m in，tem perature was 70℃，stirring speed was 2100r/m in.The synthetic technology of chrom ium and rutin was optim ized by orthogonal experim ental design method.It was verified by infrared spectroscopy that had generated a combination of chrom ium and rutin.The combination of rutin and chrom ium was detected in X－ray diffraction spectroscopy，found that contains a lot of NaCl，and then purified it.Inductively coup led plasma atom ic em ission spectrometer(ICP－AES)measurement of chrom ium content to know the purity of the purified chrom ium rutin increased 6 times.ICP－AESmethod measured themass fraction of chrom ium that was 3.8%，the combination of rutin and chrom ium on streptozotocin(STZ) －induced W istar rat model of high blood sugar had a supplementary role in lowering blood sugar，through animal experiments.

com position of rutin and chrome;synthesis;detection;blood sugar reduction

TS201.4

A

1002－0306(2011)06－0376－05

2011－02－15 *通訊聯(lián)系人

黃建東(1983－)，男，在讀研究生，研究方向:天然產(chǎn)物提取與應(yīng)用。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(20100400706)。