大孔吸附樹(shù)脂分離純化白術(shù)水煎液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的工藝研究

李鴻翔，鄧赟，彭騰，李伯群，賀鋼民，賈波，楊菁

白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，其含有的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ據(jù)報(bào)道具有抑制子宮收縮[1]、抑制小鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)[2]、促進(jìn)脾虛大鼠胃腸道消化吸收功能[3]的藥理作用，是白術(shù)中的有效成分之一，但是目前對(duì)白術(shù)水煎液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的分離純化工藝尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比6種大孔樹(shù)脂的吸附和解吸附實(shí)驗(yàn)篩選出適合分離純化白術(shù)水煎液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的樹(shù)脂，并優(yōu)化了其工藝參數(shù)。

1 儀器與材料

SSI-series 1500高效液相色譜儀（美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司），F(xiàn)A2004N電子天平(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)色譜柱YMC-Pack ODS-AQ（250×4.6mmL.D S-5μm 12nm ）,ZTC-3、DM130、NKA-Ⅱ、AB-8、DA201、D101大孔樹(shù)脂（天津海光化工有限公司），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ>98%(自制)，甲醇（分析純），白術(shù)（四川新荷花中藥飲片有限公司，批號(hào)：0907034，產(chǎn)地：浙江）。

2 實(shí)驗(yàn)方法[4~6]

2.1 白術(shù)提取液的制備

用天平稱取白術(shù)500g，加入10倍量水浸泡1h，自沸騰時(shí)起保持微沸1h，過(guò)濾，加入6倍量水條件同上煎煮1h，過(guò)濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶液至2000mL，冷卻后加入85%的乙醇至60%，靜置24h，過(guò)濾除去多糖，回收溶液至1000mL。

2.2 含量測(cè)定

用高效液相色譜法測(cè)定提取液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量，在1-50μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=1.4802x+10062（y為峰面積，x為濃度，R2=0.9998），色譜條件為：乙腈:水=55:45，波長(zhǎng)：220nm，進(jìn)樣量：10μl，柱溫為常溫。

2.3 大孔樹(shù)脂的篩選

2.3.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理 用95%的乙醇浸泡各類大孔樹(shù)脂24h，然后用95%醇沖洗至洗脫液與蒸餾水1:1混合不渾濁為止，改用水洗至洗脫液無(wú)醇味，用水浸泡備用。

2.3.2 靜態(tài)吸附量的考察 分別精密稱取6種已處理好的濕大孔樹(shù)脂約2g，置250mL具塞錐形瓶中，各加入濃度為3.64μg/mL的白術(shù)提取液50mL，將具塞錐形瓶放入恒溫?fù)u床25°C恒溫振蕩24h（80r/min）,充分吸附后，過(guò)濾，測(cè)定濾液（吸附液）中剩余白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度，計(jì)算吸附量。

2.3.3 解析率的考察 取過(guò)濾后的樹(shù)脂，加蒸餾水50mL，于25°C恒溫振蕩120min，過(guò)濾。向上述樹(shù)脂中加入50mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，室溫下振蕩（80r/min）解吸24h，至解吸平衡，過(guò)濾，測(cè)定濾液（解吸液）中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度。計(jì)算解吸率。

2.3.4 大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)篩選的結(jié)果，精密稱取篩選的樹(shù)脂約2g，裝入250mL具塞試管磨口三角瓶中，加入濃度為6.10μg/mL的白術(shù)提取液50mL，25°C恒溫振蕩（80r/min）,每1h取1mL，測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

2.4 大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的動(dòng)態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)

2.4.1 吸附流速的影響 將3份濃度為4.35μg/mL的白術(shù)提取物3BV分別以1、2、3BV/h流速上樣，待提取液全部通過(guò)樹(shù)脂后，測(cè)定流出液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度，以流速為橫坐標(biāo)，流出液濃度為縱坐標(biāo)做圖。

2.4.2 上樣濃度的影響 將4份不同濃度（50.26μg/mL、39.49μg/mL、16.52μg/mL、6.47μg/mL）的白術(shù)提取液3BV以2BV/h的流速進(jìn)行上柱，收集流出液，測(cè)定流出液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度，以流出液中濃度為縱坐標(biāo)，以濃度編號(hào)為橫坐標(biāo)作圖。

2.4.3 最大上樣量的確定 將選定大孔樹(shù)脂濕法裝柱后，以1BVmL/h的流速連續(xù)加入濃度為16.52μg/mL的白術(shù)提取液，每0.5BV收集為一份，測(cè)定流出液的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量，以流出液體積為橫坐標(biāo)，以流出液中的濃度為縱坐標(biāo)做圖。

2.4.4 洗脫劑濃度的考察 將4根選定好的大孔樹(shù)脂濕法裝柱后，各加入3BV濃度為7.00μg/mL的白術(shù)提取液，吸附4h，分別用4BV蒸餾水、4BV30%、4BV50%、4BV70%的乙醇洗脫，流速為2BV/h，每1BV收集一份，測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，洗脫液濃度為縱坐標(biāo)畫(huà)圖。

2.4.5 洗脫流速的考察 將4根選定好的大孔樹(shù)脂濕法裝柱后，各加入3BV濃度為39.50μg/mL的白術(shù)提取液，吸附4h，以3BV70%乙醇為洗脫劑，不同的洗脫流速（1、2、3、4BV/h）進(jìn)行解吸，以洗脫流速為橫坐標(biāo)，洗脫液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度為縱坐標(biāo)作圖。

2.4.6 洗脫曲線的考察 將濃度為14.52μg/mL的白術(shù)提取液按照上述確定的吸附和洗脫條件，進(jìn)行上柱、吸附和洗脫，以每1BV為一份，連續(xù)接取。對(duì)洗出餾分進(jìn)行檢測(cè)，以流出液體積為橫坐標(biāo)，以每份流出液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度為縱坐標(biāo)作圖繪制洗脫曲線。

3.結(jié)果與討論

3.1 大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

3.1.1 大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的吸附量和解吸率的考察 不同種類型大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的吸附量和解吸率見(jiàn)表1。由表1可知AB-8對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ有較大的吸附量和比較高的解吸率，因此選擇AB-8大孔樹(shù)脂做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

表1 不同大孔樹(shù)脂的吸附量與解析率

3.1.2 大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

評(píng)價(jià)大孔樹(shù)脂不僅要考慮吸附量和解析率還要考慮其吸附速率，AB-8對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖中可以看出AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ吸附開(kāi)始階段變化較快，4h以后基本達(dá)到平衡狀態(tài)。

3.2 大孔樹(shù)脂對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

3.2.1 吸附流速的影響 （見(jiàn)圖2）。

從圖2可以看出隨著吸附流速的增大流出液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量也增大，可能是因?yàn)闆](méi)有和大孔樹(shù)脂充分接觸而流出，考慮到工作效率選擇大孔樹(shù)脂的吸附流速為2BV/h。

3.2.2 上樣濃度的影響 （見(jiàn)圖3）。

從左到右上柱提取液濃度分別為50.26μg/mL，39.49μg/mL，16.52μg/mL，6.47μg/mL。

從圖3可以看出上樣濃度越高洗脫液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量也越高，結(jié)合工作效率選擇40μg/mL左右的濃度為上樣濃度。

3.2.3 最大上樣量的確定 （見(jiàn)圖4）。

從圖4中可以看出在此濃度下上樣體積在8BV以前流出液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的變化不大，在9BV的時(shí)候白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ開(kāi)始出現(xiàn)泄漏，所以此濃度下白術(shù)提取液的上樣體積為9BV左右。

3.2.4 洗脫劑濃度的考察 （見(jiàn)圖5）。

從圖中可以看出水和30%左右的乙醇洗脫液中基本不含有白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，50%左右的乙醇中有少量白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ但不能全部洗出，所以我們選擇用30%左右的乙醇3BV洗脫提取液中的雜質(zhì)，然后選用70%的乙醇繼續(xù)進(jìn)行洗脫。

3.2.5 洗脫流速的考察 （見(jiàn)圖6）。

由圖6可知隨著洗脫流速的增大流出液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量減小，考慮到工作效率我們選擇2BV/h的流速為洗脫流速。

3.2.6 洗脫曲線的考察 （見(jiàn)圖7）。

從圖7可以看出當(dāng)洗脫體積為9BV時(shí)洗脫液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量已經(jīng)很小，所以我們選擇9BV的洗脫劑進(jìn)行洗脫。

4 討論

4.1 白術(shù)是一種常用藥材，目前尚無(wú)確切的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ做為白術(shù)中一種有效成分，用來(lái)評(píng)價(jià)白術(shù)提取物優(yōu)劣較為恰當(dāng)。本工藝對(duì)白術(shù)提取物純化工藝進(jìn)行研究，確定了白術(shù)提取物的最佳純化工藝，為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的分離純化提供了理論基礎(chǔ)。

4.2 由于白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的最大吸收波長(zhǎng)為220nm，所以我們選擇220nm的波長(zhǎng)為測(cè)量波長(zhǎng)，考察了甲醇:水、乙腈:水的不同比例，結(jié)果以乙腈和水在55:45的條件下和其他峰的分離度良好，所以我們選擇流動(dòng)相的比例為乙腈:水=55:45。

[1] ZhangYQ,XμSB,LinYC,et al.Antagonistic effects of 3 sesqμiterpene lactones from Atractylodesmacrocephala Koidz on rat μterine contraction in vitro[J].Acta Pharmacol sinica,2000,21(1):91.

[2] 張奕強(qiáng),許實(shí)波,林永成.白術(shù)內(nèi)酯系列物的胃腸抑制作用[J].中藥材,1999,22(12):636.

[3] 郝延軍,桑育黎.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ對(duì)脾虛大鼠胃腸道消化吸收的影響[C].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第五屆中藥炮制分會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集,2005:215.

[4] 李洪洋,文連奎.大孔樹(shù)脂分離純化五味子醇甲的研究[J].食品與機(jī)械,2011,27(3):56.

[5] 周洪偉,許文博.赤芍總苷提取與大孔樹(shù)脂純化工藝研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2011,39(1):48.

[6] 張影,羅佳波.雙黃連酚針中連翹用大孔樹(shù)脂精制的工藝研究[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(3):75.