SSR－PCR和常規(guī)PCR檢測不同地區(qū)并殖吸蟲遺傳變異的比較研究＊

單小云，樓宏強(qiáng)，胡 野，樓 景，屠平光，方 萍

并殖吸蟲是重要的食源性人獸共患并殖吸蟲病的病原體。全球已報(bào)告有50多種，我國報(bào)告的蟲種多達(dá)29種，其中有些是同物異名，對(duì)于并殖吸蟲蟲種的獨(dú)立性長期以來存在著較多爭議［1］。近些年國內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)學(xué)、生活史、分子水平等方面探討我國不同地區(qū)的并殖吸蟲的遺傳變異及分類，其中分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為并殖吸蟲蟲種分類研究提升到新的水平提供了條件。本研究采用簡單重復(fù)序列錨定 PCR（simple sequence repeat－anchored PCR，SSR－PCR）對(duì)我國5個(gè)地區(qū)的并殖吸蟲的遺傳變異進(jìn)行研究，并與常規(guī)PCR進(jìn)行比較，以了解并殖吸蟲不同地域株的遺傳變異情況，為并殖吸蟲的分子生物學(xué)技術(shù)分類提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本及其鏡下觀察 從浙江金華、永嘉，福建平和、政和、周寧的并殖吸蟲病流行區(qū)采集淡水蟹，以雙篩水洗法分離到5地的溪蟹囊蚴。各地標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)囊蚴于解剖鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，測量囊蚴大小、內(nèi)外壁厚度，初步判斷并殖吸蟲蟲種。

1．2 囊蚴基因組DNA的提取 按照Promega公司基因組DNA提取試劑盒（Wizard SV Genomic DNA Purification System）使用說明書提取成蟲基因組DNA。

1．3 PCR擴(kuò)增

1．3．1 引物設(shè)計(jì)

1．3．1．1 SSR－PCR 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)［2－3］的方法，選用引物5’－（CA）8RY－3’，即5’－CACACACACACACACARY－3’，共18個(gè)堿基。

1．3．1．2 常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)COI和ITS2基因序列［4］，自行設(shè)計(jì)引物，COI基因引物序列為：上游5’－CCT GAT TTT GCC TGG GTT

TG－3’，下游5’－ACG ACG AAC CAC GTA TCA T－3’。ITS2基因引物序列為：上游5’－ATA TTG CGG CCA CGG GTT A－3’，下游5’－GGT ACT CAC GTC TGA TCC G－3’。

上述引物委托上海Invitrogen公司合成。

1．3．2 PCR反應(yīng)體系和條件

1．3．2．1 SSR－PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件 參照文獻(xiàn)［5－6］的方法，總反應(yīng)體系：DNA 模板2．5μL、10×PCR緩沖液2．5μL、dNTP混合物（2．5mmol／L）2 μL、Ex Taq酶（5U／μL）0．25μL、引物（10μmol／L）0．5μL，加ddH2O至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃4min；94℃30s，54℃45s，72℃90s，共37個(gè)循環(huán)；72℃7min。

1．3．2．2 常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件 COI反應(yīng)體系：模板DNA1μL，10×PCR緩沖液2．5μL，25mmol／L MgCl24μL，dNTP混合物（2．5mmol／L）2μL，上、下游引物（50pmol／μL）各0．25μL，Ex Taq酶（5U／μL）0．25μL，加ddH2O至25μL。反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃5min。ITS2基因反應(yīng)體系和擴(kuò)增反應(yīng)條件同COI基因。

1．3．3 結(jié)果分析

1．3．3．1 電泳檢測 用溴乙錠預(yù)染色的1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存結(jié)果。

1．3．3．2 SSR－PCR條帶分析 根據(jù)SSR－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，比較不同標(biāo)本的條帶，按Nei的方法［7］計(jì)算相似系數(shù)（Genetic Similary）和遺傳距離（Genetic Distance）。遺傳相似系統(tǒng) GS＝2Nij／（Ni＋Nj），其中Nij指材料i和材料j共同所有的片段數(shù)，Ni＋Nj指兩個(gè)材料中出現(xiàn)的片段數(shù)目之和。遺傳距離GD＝1－GS。運(yùn)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行聚類分析。

1．3．3．3 常規(guī)PCR結(jié)果分析 常規(guī)PCR產(chǎn)物委托上海Invitrogen公司測序，COI和ITS2基因測序結(jié)果用BoiEdit軟件進(jìn)行同源性分析，用MEGA5．0軟件的最小進(jìn)化法（ME）構(gòu)建種系發(fā)生樹［8］。

2 結(jié) 果

2．1 囊蚴 除福建平和的并殖吸蟲囊蚴從溪蟹的心臟組織分離外，其余均從肌肉組織中檢出，形態(tài)呈圓形或近圓形。浙江金華、浙江永嘉、福建周寧的囊蚴大小為320±40μm，壁2層，厚約15～24μm；福建政和的囊蚴大小為430±10μm，內(nèi)外壁厚度分別為13～15μm與3～5μm；福建平和的囊蚴大小420±20μm，囊內(nèi)蚴體充滿或有小空隙，蚴體多蜷曲成U形，排泄囊只達(dá)到腹吸盤。

2．2 SSR－PCR擴(kuò)增和分析結(jié)果

2．2．1 SSR－PCR 擴(kuò)增條帶 并殖吸蟲的 SSRPCR產(chǎn)物呈多態(tài)性，共出現(xiàn)18條不同條帶，每個(gè)標(biāo)本條帶數(shù)量在3～6條之間，長度在200～1 000bp之間，見圖1。

2．2．2 遺傳距離和聚類分析 SSR－PCR擴(kuò)增條帶分析顯示，5地并殖吸蟲標(biāo)本的遺傳距離為0．3333－0．8667，見表1。根據(jù)樹狀圖將不同地區(qū)的并殖吸蟲分為3類：浙江金華、浙江永嘉、福建周寧為一類，其中浙江金華、浙江永嘉標(biāo)本為一小類；福建政和和福建平和標(biāo)本各為一類，見圖2。

2．3 常規(guī)PCR擴(kuò)增和分析結(jié)果

2．3．1 常規(guī)PCR擴(kuò)增測序結(jié)果 測序顯示，浙江金華、浙江永嘉、福建周寧、福建平和標(biāo)本的COI基因?yàn)?90堿基對(duì)，福建政和標(biāo)本為388堿基對(duì)；浙江金華、浙江永嘉、福建周寧標(biāo)本的ITS2基因?yàn)?63堿基對(duì)，福建政和標(biāo)本為361堿基對(duì)，福建平和為357堿基對(duì)，見圖3。

圖1 不同地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本的SSR－PCR檢測結(jié)果M：Marker；1：金華；2：永嘉；3：周寧；4：政和；5：平和Fig．1 SSR－PCR detection results of Paragonimus specimen in different areasM：DNA mark；1：Jinhua；2：Yongjia；3：Zhouning；4：Zhenghe；5：Pinghe

表1 根據(jù)SSR－PCR結(jié)果計(jì)算的不同地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本遺傳距離Tab．1 The genetic distance of Paragonimusin different areas counted by SSR－PCR

圖2 根據(jù)SSR－PCR電泳圖制作的不同地區(qū)并殖吸蟲系統(tǒng)樹圖Fig．2 The dendrogram of Paragonimus in different areas made with the SSR－PCR electrophoretogram

2．3．2 同源性和遺傳距離分析 BoiEdit軟件分析顯示，5個(gè)地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本的COI基因和ITS2基因的同源性分別為76．9%～98．9%和85．9%～99．4%，見表2和表3。

將MEGA格式排列的COI和ITS2序列分別輸入MEGA建樹，結(jié)果見圖4，5。系統(tǒng)進(jìn)化樹將5地并殖吸蟲在基因水平上分為3大類：浙江金華、浙江永嘉、福建周寧標(biāo)本為一類，其中浙江金華、浙江永嘉標(biāo)本為一小類；福建政和和福建平和標(biāo)本各為一類。

圖3 不同地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本COI和ITS2基因的PCR檢測結(jié)果M：Marker；1－5：金華、永嘉、周寧、政和、平和標(biāo)本 COI基因；6－10：金華、永嘉、周寧、政和、平和標(biāo)本的ITS2基因Fig．3 PCR detection results of COI and ITS2gene of Paragonimusin different areasM：marker；1－5：COI gene of specimen in Jinhua，Yongjia，Zhouning，Zhenghe，Pinghe；6－10：ITS2gene of specimen in Jinhua，Yongjia，Zhouning，Zhenghe，Pinghe

表2 不同地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本COI基因同源性比較Tab．2 A comparison of COI gene homology of Paragonimus in different areas

表3 不同地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本ITS2基因同源性比較Tab．3 A comparison of ITS2gene homology of Paragonimus in different areas

圖4 不同地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本的COI基因種系發(fā)生樹Fig．4 COI gene stammbaum of Paragonimusin different areas

3 討 論

圖5 不同地區(qū)并殖吸蟲標(biāo)本的ITS2基因種系發(fā)生樹Fig．5 ITS2gene stammbaum of Paragonimusin different area

并殖吸蟲的分類手段從19世紀(jì)后半葉以來以形態(tài)生活史為主要根據(jù)，上個(gè)世紀(jì)60－80年代出現(xiàn)了染色體、同工酶等技術(shù)［1］，隨著分子生物技術(shù)在20世紀(jì)90年代的快速發(fā)展，SSR－PCR被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各方面的研究，如法醫(yī)鑒定、遺傳病的基因診斷、腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、分類學(xué)、種群研究等［5］，特別是在枯氏錐蟲、血吸蟲、利什曼原蟲等寄生蟲分類學(xué)方面的研究較多［9］，為SSR－PCR在并殖吸蟲種群分類研究提供了基礎(chǔ)。

本研究首先根據(jù)各地并殖吸蟲囊蚴的形態(tài)特征和大小，結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)資料，初步確認(rèn)浙江金華、浙江永嘉、福建周寧的標(biāo)本為衛(wèi)氏并殖吸蟲，福建政和的標(biāo)本為斯氏并殖吸蟲，福建平和的標(biāo)本為三平正并殖吸蟲。利用SSR－PCR結(jié)果計(jì)算出的遺傳距離顯示，浙江金華、浙江永嘉和福建周寧標(biāo)本的遺傳距離較近，為0．3333和0．4286；浙江金華與福建政和、福建平和遺傳距離較遠(yuǎn)，為0．8333和0．8667，遺傳距離的遠(yuǎn)近與囊蚴形態(tài)差異基本一致。作者利用常規(guī)PCR擴(kuò)增了金華市并殖吸蟲蟲種的COI和ITS2基因，并與GNEBANK中已報(bào)道的衛(wèi)氏并殖吸蟲進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹的研究，從分子生物學(xué)角度證實(shí)了浙江金華標(biāo)本為衛(wèi)氏并殖吸蟲［10］。本研究結(jié)果顯示，浙江金華、浙江永嘉、福建周寧的標(biāo)本COI基因和ITS2基因的同源性分別為98．2%～98．9%和99．1%～99．4%，可確定浙江金華、浙江永嘉和福建周寧標(biāo)本為衛(wèi)氏并殖吸蟲。

雖然浙江金華、浙江永嘉和福建周寧標(biāo)本為衛(wèi)氏并殖吸蟲，但SSR－PCR和常規(guī)PCR構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，浙江金華與永嘉標(biāo)本的遺傳距離比浙江金華與福建周寧、浙江永嘉與福建周寧標(biāo)本之間的遺傳距離更近，可能是因?yàn)檎憬鹑A（東經(jīng)119°38′，北緯29°04′）、浙江永嘉（東經(jīng)120°41′，北緯28°09′）同福建周寧的地理位置相距較遠(yuǎn)，許多物理因素和生物因素如日照、大氣濕度和溫度都會(huì)影響到物種間的遺傳差異。

由于微衛(wèi)星DNA具有高度多態(tài)性、分布廣、按孟德爾共顯性方式遺傳，SSR－PCR所用引物為標(biāo)準(zhǔn)化引物、不需要特殊設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增前也不需要預(yù)知模板 DNA 信息等優(yōu)點(diǎn)［11－12］，本研究利用 SSRPCR和常規(guī)PCR檢測結(jié)果為基礎(chǔ)繪制的樹狀圖均將不同地區(qū)并殖吸蟲分3大類：浙江金華、浙江永嘉和福建周寧為一類，福建政和、福建平和各為一類，浙江金華與浙江永嘉標(biāo)本最近，浙江金華與福建政和最遠(yuǎn)。說明兩種技術(shù)用于并殖吸蟲分類的結(jié)果基本一致，而且與不同疫區(qū)囊蚴形態(tài)判定的不同蟲種之差別相吻合。因此，SSR－PCR是一種比較方便可靠的并殖吸蟲遺傳變異研究方法，將為寄生蟲鑒定與分類方面增加新的手段與方法。

（蒙華東地區(qū)肺吸蟲病防治研究協(xié)作組李友松主任、陳韶紅研究員指導(dǎo)，特此致謝。）

［1］沈一平，邵向云，李友松，等．實(shí)用肺吸蟲病學(xué)［M］．2版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：49－50．

［2］李莉，牛安歐，劉蓉，等．用SSR－PCR和RAPD技術(shù)研究中國不同地域旋毛蟲的遺傳變異［J］．中國人獸共患病雜志，2004，20（9）：757－761．

［3］Angela Cristina Volpini，Valéia Maria de Azeredo Passos，Alvaro JoséRomanha．Attempt to differentiate Leishmania （Leishmania）amazonensis，L．（L．）chagasi，Leishmania（Viannia）braziliensis and L．（V．）guyanensis using the SSR－PCR technique［J］．Parasitol Res，2001，87 ：1056－1059．

［4］Blair D，Agatsuma T，Watanobe T，etal．Geographical genetic structure within the human lung fluke，Paragonimus westermanni，detected from DNA sequence［J］．Parasitology，1997，115（4）：411－418．

［5］熊衍文，年安歐．微衛(wèi)星錨定PCR及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用［J］．中國寄生蟲病防治雜志，2002，15（1）：51－54．

［6］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D，etal．Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR ）－anchored polymerase chain reaction amplication［J］．Genomic，1994，20 （2）：176－183．

［7］Nei M，Li WH．Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］．Proc Natl Acad Sci US A，1979，76（10）：5269－5273．

［8］崔愛利，常正山，陳名剛，等．用DNA序列分析我國5種并殖吸蟲的分類地位［J］．中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2003，21（1）：27－30．

［9］Oliveira RP．An alternative approach to evaluating the intra specific genetic variability of parasites［J］．Parasitol Today，1997，13（5）：196－200．

［10］樓宏強(qiáng)，胡野，金耀建，等．浙江省金華地區(qū)并殖吸蟲自然宿主調(diào)查及蟲種鑒定［J］．中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2011，29（5）：81－85．

［11］Litt M，Luty JA．A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene［J］．Am J Hum Genet，1989，44（3）：397－401．

［12］Weber JL，May PE．Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction［J］．Am J Hum Genet，1989，44（3）：388－396．