家畜戊型肝炎病毒診斷方法的建立及應(yīng)用＊

蘇乾蓮，李 斌，趙 武，秦毅斌，梁家幸，肖愛歡，段群棚，何 穎，黃偉堅

2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的一種經(jīng)消化道傳播的急性病毒性肝炎，呈全球分布，以暴發(fā)流行或散發(fā)感染的形式存在。其臨床和流行病學(xué)特點類似甲型肝炎，但主要侵犯青壯年，孕婦感染后病死率可高達20%［1］。1997年，Meng等在美國豬體首次分離到HEV毒株，發(fā)現(xiàn)其與美國人源HEV高度相似，并發(fā)現(xiàn)其可感染黑猩猩和恒河猴，從而首次證實了HEV種間傳播的可能性［2］。隨后，陸續(xù)在狗、貓、羊、牛、馬等與人類密切相關(guān)的動物中發(fā)現(xiàn)HEV抗體或 RNA，但仍需要進一步深入研究［3－8］。

2007年第12屆國際病毒性肝炎和肝病研討會上，將HEV分為5個基因型，I型和II型僅感染人，III型和IV型為人獸共患，禽HEV被歸為戊型肝炎病毒屬，暫定為基因V型［9］。在前人研究基礎(chǔ)上，本研究建立檢測家畜基因I型－IV型HEV通用性RT－nPCR，并對采自廣西各地的豬、牛、羊肝糞樣本進行HEV檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIZOL Regent為Invitrogen產(chǎn)；d NTP為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)；Ribonuclease Inhibitor為 Ta KaRa產(chǎn)；M－MLV Reverse Transcriptase為 Promega產(chǎn)；Dream TaqTMDNA Polymerase為Fermentas產(chǎn)；Mark1為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)。

1.2 樣本和對照品 采集廣西地區(qū)豬、牛、羊新鮮糞便樣本以及各地市場銷售或屠宰場新鮮家畜肝臟，盡快檢測或－20℃保存?zhèn)錂z。戊型肝炎病毒陽性樣本由廣西大學(xué)贈送；豬瘟病毒（CSFV）、偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、乙腦病毒（JEV）由本實驗室保存；陰性對照為DEPC水。

1.3 引物設(shè)計及合成 參考GenBank上4種基因型HEV核苷酸序列，應(yīng)用生物軟件Oligo6.0在ORF2保守區(qū)設(shè)計兩對簡并引物，外套引物為：HEV－A/B，內(nèi)套引物為：HEV－C/D，擴增片段長為436 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：HEV－A：5’－TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG－3’； HEV－B：5’－TGYTGGTTRTCRTARTCCTG－3’；HEV－C：5’－ATWCATGGVTCRCCTGTGAA－3’；HEV－D：5’－TRTCCTGCTGMGCRTTCTC－3’。

1.4 樣本的處理 挑取0.4g新鮮糞便樣本于5 m L離心管內(nèi)，加入4m L滅菌 PBS（0.01 mol/L，p H7.2）進行稀釋，旋渦震蕩混勻，制備成10%的糞便懸液，4℃，10 000 r/min離心10 min，抽取上清進行RNA抽提或－20℃保存。取肝臟2.0 g于無菌研缽，研磨并用PBS稀釋成1∶5乳劑，反復(fù)凍融3次后10 000 r/min離心1 0min，取上清進行RNA抽提或于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒RNA的提取 取樣本上清液250μL于1.5 m L的EP管（DEPC水處理，高壓滅菌），加入800μL Trizol，反復(fù)顛倒數(shù)次充分混勻后，室溫放置10 min；加入210μL氯仿，反復(fù)顛倒數(shù)次充分混勻（成乳白色為止），室溫下放置3 min；4℃，12 000 r/min離心10 min后，小心取350μL上層液體，轉(zhuǎn)移到一個新的EP管，再加入等量預(yù)冷異丙醇（350 μL），溫和混勻，室溫下放置10 min；4℃，12 000 r/min離心10 min后，棄去上清，加入500μL 75%預(yù)冷酒精，溫和混勻，8 000 r/min離心5 min；將抽提RNA置50℃溫箱內(nèi)晾干（管壁上水滴消失即可）后，加入35μL無RNase的水，用移液器反復(fù)溫和吹勻，并于50℃水浴5 min至RNA充分溶解；即用或－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng) 本實驗的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25μL，其中 RNA 模板16μL，d NTP（10 mmol/L）混合物2μL，5×Buffer緩沖液5μL，MMLV Reverse Transcriptase（反轉(zhuǎn)錄酶）（200 U/μL）0.5μL，Rnasin Inhibitor（抑制劑）（40 U/μL）0.5μL，外套下游引物（25 mmol/L）1μL，各試劑混勻后42℃反轉(zhuǎn)錄1 h。PCR反應(yīng)體系25μL，滅菌水17.75μL，10×PCR 緩 沖 液 2.5μL，d NTP（10mmol/L）混合物0.5μL，上下游引物（25 mmol/L）各0.5μL，Taq酶（5 U/μL）0.25μL，模板3μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；第二次PCR進行30個循環(huán)，其它反應(yīng)條件與首輪PCR反應(yīng)條件相同。

1.7 特異性試驗 提取陽性對照、對照樣本和陰性對照的核酸，用建立的RT－nPCR方法進行檢測，電泳觀察結(jié)果。

1.8 敏感性試驗與重復(fù)性檢驗 經(jīng)紫外分光光度計測量陽性樣本的核酸濃度，并做10倍梯度稀釋至10－8，提取每個稀釋度的RNA作模板分別進行RT－nPCR。對6份不同的陽性樣本分別進行3次重復(fù)性試驗，檢驗該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 HEV RT－nPCR的臨床應(yīng)用 用建立的RT－nPCR方法對采自廣西各地豬、牛、羊的905份糞便樣本，272份肝臟樣本進行HEV檢測。

2 結(jié) 果

2.1 HEV RT－nPCR的特異性 只有HEV陽性樣本在436 bp出現(xiàn)特異性條帶，表明以HEV特異性引物不能檢測出CSFV、PRV、PRRSV、PPV和JEV的核酸，顯示RT－n PCR檢測HEV具有良好特異性。

圖1 HEV RT－nPCR的特異性檢測M：Mark1；1：HEV陽性樣本；2：陰性對照；3：豬瘟病毒；4：偽狂犬病毒；5：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；6：豬細(xì)小病毒；7：乙腦病毒Fig.1 Specificity evaluation of the RT－nPCR assay Land M：Mark1；1：HEV positive sample；2：negative control；3：CSFV；4：PRV；5：PRRSV；6：PPV；7：JEV

2.2 HEV RT－nPCR的敏感性與重復(fù)性 陽性樣本的核酸濃度為30.30μg/m L，樣本可檢測到3.030 pg/μL。6份不同的陽性樣本3次重復(fù)性檢測均呈陽性，說明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.3 臨床肝糞樣本HEV的RT－nPCR檢測 臨床檢測廣西地區(qū)豬、牛、羊糞便樣本陽性率31.49%（285/905），豬、牛、羊肝臟樣本陽性率17.31%（49/272）。

3 討 論

目前，HE的檢測診斷最常用的是ELISA方法。血清學(xué)ELISA檢測抗－HEV IgG顯示廣西部分地區(qū)存在多種動物 HEV的感染［10－11］。然而，目前家畜的HEV血清學(xué)ELISA抗體檢測方法尚無標(biāo)準(zhǔn)化，而且血清成分較復(fù)雜，容易造成假陽性，同時已有報道在HEV血清學(xué)陰性的臨床樣本中檢測到HEV RNA［12］。HEV通過糞便排毒所持續(xù)的時間要比病毒血癥持續(xù)的時間長［13］，而且作為HEV主要病毒載體的糞便以及肝臟作為檢測對象更容易檢測到HEV核酸，因此家畜的HEV病原監(jiān)測比血清學(xué)抗體監(jiān)測更為確切。套式RT－PCR已經(jīng)用于HEV的臨床檢測，目前較常用的引物有 Meng、ConORF1、ConORF2和E引物，本研究建立的RT－nPCR檢測方法的引物主要針對基因I－IV型人畜HEV ORF2（其對于基因V型禽類HEV無法檢測出，針對V型禽類HEV RT－nPCR檢測方法的建立及應(yīng)用另文刊發(fā)），該RT－nPCR具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，前期應(yīng)用表明具有良好的可行

性［14］。

廣西是人HE的高發(fā)區(qū)，農(nóng)村人群HEV抗體陽性率高達43%，而且亦已證實人感染HEV途徑主要是通過接觸豬及其排泄物而并非人與人之間接觸傳播［15］。廣西農(nóng)村人群HEV抗體陽性率較高可能與廣大農(nóng)村地區(qū)大都有將豬、牛、羊圈養(yǎng)在自己的屋子旁邊的習(xí)慣，而且管理條件及衛(wèi)生狀況較差，易通過糞－口途徑感染HEV具有密切關(guān)系。本研究通過對HEV主要載體糞肝的檢測證實廣西豬、牛、羊群存在HEV感染，進一步證實感染家畜及市售帶毒家畜肝臟是HEV重要的儲存庫和傳染源，應(yīng)該重視其公共衛(wèi)生學(xué)意義，預(yù)防糞－口途徑或者食源性HEV感染。

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