甲型副傷寒桿菌重組蛋白Omp W的表達(dá)與鑒定＊

林飛飛，馮康樂，雷銀蕉，戎春浩，盛 思，阮 萍

沙門菌（Salmonella）是一類兼性胞內(nèi)寄生菌。沙門菌血清型眾多，其中傷寒沙門菌和副傷寒沙門菌感染引起的傷寒和副傷寒是發(fā)展中國家高發(fā)的腸道傳染病，每年導(dǎo)致近60萬人死亡，我國每年報(bào)告?zhèn)案眰±龜?shù)近2萬例。近年來，甲型副傷寒沙門菌在我國開始流行，在一些省或自治區(qū)人群中超過傷寒沙門菌而成為優(yōu)勢菌型［1－2］，且甲型副傷寒沙門菌耐藥性逐年增強(qiáng)。目前我國普遍采用以莢膜多糖為抗原的Vi疫苗來預(yù)防傷寒或副傷寒，但甲型副傷寒桿菌無多糖莢膜，故Vi疫苗無預(yù)防甲型副傷寒效果［3］。因此，篩選甲型副傷寒桿菌保護(hù)性表面蛋白抗原，進(jìn)而研制甲型副傷寒疫苗，對(duì)于預(yù)防和控制甲型副傷寒的流行具有重要意義。

外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）通常是沙門菌等革蘭陰性細(xì)菌主要表面抗原之一。根據(jù)甲型副傷寒桿菌全基因組序列［4］，該菌至少有21個(gè)OMP編碼基因，其中肯定的主要OMPs有spaO、omp A、omp C、omp N、ompS、omp W、nmp C等，根據(jù)查閱文獻(xiàn)，spaO、omp A和nmp C等已有報(bào)道或正在研究之中，故根據(jù)甲副傷寒桿菌ATCC9150株全基因組序列中對(duì)omp W基因產(chǎn)物“Surface antigen”的詮釋，我們選擇了omp W作為研究對(duì)象，進(jìn)行其基因產(chǎn)物的研究。本研究中，我們檢測了我國甲型副傷寒桿菌臨床菌株中omp W基因攜帶率，構(gòu)建了omp W基因原核表達(dá)系統(tǒng)并鑒定了重組表達(dá)產(chǎn)物r Omp W的免疫原性，以期為r Omp W用作甲型副傷寒桿菌基因工程疫苗抗原提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及培養(yǎng) 甲型副傷寒桿菌參考標(biāo)準(zhǔn)株50001購自北京中國藥品生物制品檢定所。95株分離自患者并經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定的甲型副傷寒桿菌株由浙江省寧波市和溫嶺市疾病預(yù)防控制中心提供。上述菌株采用細(xì)菌營養(yǎng)肉湯或其瓊脂（Oxoid）培養(yǎng)。原核表達(dá)載體p ET42a－E.coliBL21DE3由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院嚴(yán)杰教授惠贈(zèng)。

1.2 PCR 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（BioColor）提取上述菌株基因組 DNA，提取的DNA并溶于TE緩沖液中，采用分光光度法測定DNA濃度和純度。根據(jù)GenBank中omp W基因序列以及限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)分析結(jié)果，自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長omp W基因的PCR引物：上游5’－GCG CAT ATG （NdeI）GTG GCG GCA CAG GCG TT－3’，下游5’－GCG CTC GAG （XhoI）GAA ACG ATA GCC TGC CGA－3’。PCR引物由上海Introvigen公司合成。PCR總體積100μL，內(nèi)含2.5 mol/L各d NTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Taq－Pfu DNA聚合酶混合物、100 ng DNA模板和1×PCR緩沖液（TaKaRa）。PCR參數(shù)：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。采用1μg/m L溴乙錠預(yù)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，目的產(chǎn)物預(yù)期大小為624 bp。

1.3 T－A克隆和原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建 采用T－A克隆試劑盒（BioDev－Tech）將甲型副傷寒桿菌JH01臨床菌株omp W基因擴(kuò)增片段克隆至PMD18－T中形成重組質(zhì)粒PMD18－TompW，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α并在LB培養(yǎng)液（Oxoid）中擴(kuò)增，采用小量質(zhì)粒試劑提取盒（BioDev－Tech）提取質(zhì)粒，委托上海Introvigen公司測序。分別將PMD18－TompW及原核表達(dá)載體p ET42a（Novagen）用核酸內(nèi)切酶NdeI和XhoI（TaKaRa）雙酶切，回收的omp W基因片段與線性化p ET42a用T4 DNA連接酶（Ta KaRa）連接形成重組表達(dá)載體p ET42aompW。將p ET42aompW轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E.coliBL21DE3（Novagen）形成E.coliBL21DE3pET42a－ompW，該重組工程菌在LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增后提取質(zhì)粒再次測序。

1.4 目的重組蛋白表達(dá)和免疫原性鑒定 采用分別含0.1和0.5 mmol/L異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG，Sigma）的LB培養(yǎng)液，37℃震蕩培養(yǎng)4 h，以誘導(dǎo)E.coliBL21DE3pET42a－ompW表達(dá)目的重組蛋白r Omp W。用12%分離膠的 SDS－PAGE（Sigma）和Bio－Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查r Omp W表達(dá)情況及產(chǎn)量，采用 Ni－NTA親和層析柱（BioColor）提純r(jià) Omp W。將1 mg r Omp W與弗氏完全佐劑混合后背部皮內(nèi)免疫家兔4次，每次間隔1 w，末次免疫后2 w采集心血并分離血清，采用免疫雙擴(kuò)散法檢測抗血清的效價(jià)。分別以1∶200稀釋的r Omp W兔抗血清和1∶500稀釋的自制甲型副傷寒桿菌50001株全菌兔抗血清為一抗，1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（Jackson Immuno Research）為二抗，采用Western Blot檢測r Omp W的抗原性和免疫反應(yīng)性。

1.5 臨床菌株omp W基因攜帶率檢測 按上法采用PCR檢測95株甲型副傷寒桿菌臨床菌株omp W基因的攜帶情況。

2 結(jié) 果

2.1 PCR檢測結(jié)果 甲型副傷寒桿菌50001株及JH01株基因組DNA中均擴(kuò)增出預(yù)期大小的omp W基因片段（圖1）。

圖1 甲型副傷寒桿菌菌株中擴(kuò)增的ompW基因目的條帶Fig.1 The amplification fragments of target gene and DNA segmentsM：marker（Biocolor）；Lane 1：the blank control；Lane 2 and 3：the amplification fragments of the omp W genes from a S.paratyphi A strain 50001 and No.JH01，respectively.

2.2 序列分析結(jié)果 與報(bào)道的omp W基因序列（Gen Bank No.：CP000026）比較，甲型副傷寒桿菌50001株及包括JH01株在內(nèi)的10株甲型副傷寒桿菌臨床菌株omp W基因核苷酸和氨基酸序列相似性均為100%。PMD18－TompW與p ET42aompW中插入的omp W基因基因序列完全相同。上述序列比較時(shí)不包括引物序列。

2.3 r Omp W表達(dá)和提純效果 IPTG能有效地誘導(dǎo)E.coliBL21DE3pET42a－ompW表 達(dá)r Omp W，其 表 達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的25%，Ni－NTA親和層析法提純的r Omp W在分離膠中顯示為單一的蛋白條帶。

2.4 r Omp W的抗原性和免疫反應(yīng)性 r Omp W能免疫家兔后能產(chǎn)生抗體。Western blot結(jié)果證實(shí)，甲型副傷寒桿菌全菌抗血清及兔抗r Omp W血清均能識(shí)別r Omp W并產(chǎn)生陽性反應(yīng)。

2.5 臨床菌株omp W基因攜帶率 PCR結(jié)果顯示，所有甲型副傷寒桿菌臨床菌株（95/95）均攜帶omp W基因。

3 討 論

OMP是革蘭陰性菌主要表面蛋白抗原。有研究證實(shí)，沙門菌OMP可有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［5－6］，一些副傷寒桿菌OMP可誘導(dǎo)患者或?qū)嶒?yàn)感染動(dòng)物中產(chǎn)生高效價(jià)抗體［7－8］。2004年，McClelland等報(bào)告了甲副傷寒桿菌ATCC9150株全基因組序列［4］，至少有二十個(gè)明確的OMPs或推測的OMPs基因得到詮釋，其中肯定的甲副傷寒桿菌主要 OMPs有spaO、omp A、ompC、omp N、ompS、omp W、nmp C，這為研究甲副傷寒桿菌OMPs及其免疫性提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。眾所周知，與抗原構(gòu)造較為簡單的病毒不同，細(xì)菌是抗原構(gòu)造復(fù)雜多樣的原核細(xì)胞型微生物，單一細(xì)菌OMP抗原的抗體作用靶點(diǎn)極為有限，難以獲得理想的免疫保護(hù)效果，故至今從未有以單一蛋白抗原。我們認(rèn)為，必須采用多種細(xì)菌表面蛋白同時(shí)作為免疫原，才有可能獲得良好的免疫保護(hù)效果。因此，在甲型副傷寒桿菌SpaO、Omp A、H1a和nmp C抗原研究基礎(chǔ)上［9－11］，根 據(jù) 甲 副 傷 寒 桿 菌 全 基 因 組 序 列 中 對(duì)omp W基因產(chǎn)物“Surface antigen”的詮釋，進(jìn)一步研究了其基因產(chǎn)物，以期獲得更多的多價(jià)基因工程疫苗候選抗原。

本研究中，我們采用PCR和T－A克隆法從甲型副傷寒桿菌50001株及包括JH01株在內(nèi)的10株甲型副傷寒桿菌臨床菌株omp W基因克隆。與報(bào) 道 的omp W基 因 序 列 （GenBank No.：CP000026）比較，上述克隆的甲型副傷寒桿菌omp W基因核苷酸和氨基酸序列相似性均為100%，表明omp W基因序列極為保守。r Omp W免疫家兔后能產(chǎn)生特異性抗體，r Omp W不僅能與其抗血清結(jié)合，也能與甲型副傷寒桿菌全菌抗血清發(fā)生免疫反應(yīng)，表明r Omp W具有良好的抗原性和免疫反應(yīng)性。此外，蛋白抗原基因在不同來源菌株中分布廣泛，也是確定其能否作為基因工程疫苗候選抗原的基本條件之一。我們的PCR結(jié)果顯示，所有受試的95株甲型副傷寒桿菌臨床菌株均攜帶omp W基因。上述結(jié)果提示，Omp W為甲型副傷寒桿菌分布廣泛且自然表達(dá)的外膜蛋白，可作為多價(jià)基因工程疫苗的候選抗原。

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