CALM2基因多態(tài)性與青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究*

周 熹 邱貴興 吳志宏 原所茂 費(fèi) 琦 劉 正

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730)

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸 (adolescent idiopathic scoliosis，AIS)的發(fā)病原因及具體機(jī)制尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其可能是多基因遺傳病[1-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道鈣調(diào)蛋白水平增高和進(jìn)展性AIS之間有一定關(guān)聯(lián)意義[6-12]，也有研究顯示鈣調(diào)蛋白 1基因(CALM1基因)的多態(tài)性與AIS不同亞型有一定聯(lián)系[13]。與 CALM1基因一樣，鈣調(diào)蛋白 2基因(CALM2基因)同樣參與鈣調(diào)蛋白合成表達(dá)，本研究選擇CALM2基因?yàn)榭疾鞂?duì)象，研究其多態(tài)性與AIS的遺傳易感性之間的關(guān)系，并且對(duì)不同基因表型對(duì)AIS臨床亞型之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析探討。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用“病例-對(duì)照”研究方法，研究對(duì)象為中國(guó)漢族人群，包括散發(fā)性青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸病例組和正常對(duì)照組。病例組來自2005年10月至2008年2月北京協(xié)和醫(yī)院脊柱外科病房住院的中國(guó)漢族AIS患者 (Cobb角≥30°)，男17例，女90例，年齡范圍10～22歲，平均15.53±2.18歲。所有患者通過臨床和影像學(xué)確診，排除其它類型的脊柱側(cè)凸。分別記錄所有患者PUMC分型[14]資料、側(cè)凸頂點(diǎn)位置以及Cobb角。對(duì)照組來自同期北京協(xié)和醫(yī)院就診的外傷、感染患者及健康查體者，排除脊柱側(cè)凸家族史和病史。對(duì)照組男17例，女90例，年齡范圍10～20歲，平均15.12±2.59歲。所有研究對(duì)象和其家長(zhǎng)簽署知情同意書，并獲得中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 SNP(single nucleotide polymorphyism，單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)選擇 在美國(guó)NCBI-SNPs數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)和歐洲Ensembl-SNPs數(shù)據(jù)庫 (http://www.ensembl.org/index.html)中，查找 CALM2基因的已知SNPs。根據(jù)國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃 (http://www.Hapmap.org)提供的基因型數(shù)據(jù)，優(yōu)先選取雜合度高于10%，位于外顯子區(qū)域或有錯(cuò)義突變的SNPs和位于3'-、5'-調(diào)控區(qū)的SNPs作為遺傳標(biāo)記，共選取8個(gè)SNPs，具體見表1。

表1 篩查的SNPs

1.2.2 提取DNA 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)，根據(jù)它的Spin柱方案從外周全血中進(jìn)行DNA的提取，并用分光光度法對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定，最終提取DNA濃度約為25 ng/Ixl。

1.2.3 DNA濃度測(cè)定和濃縮純化 VeraCode GoldenGate Genotyping Assay檢測(cè)SNPs所需的最佳濃度為50～100 ng/μl，較提取濃度高，因此采用離心重溶解的方式進(jìn)行濃縮純化，達(dá)到要求濃度。

1.2.4 SNPs檢測(cè) 采用的VeraCode GoldenGate Genotyping Assay:96＆384-plex系統(tǒng) (Illumina公司)進(jìn)行SNPs檢測(cè)。該系統(tǒng)采用光纖微珠芯片平臺(tái)進(jìn)行基因分型，得到SNP位點(diǎn)信息。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SNPstats軟件 (Availability:http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)[15]、 SAS 8.2 軟 件、Haploview 4.0(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)等統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，進(jìn)行基因型頻率分布的Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)，單位點(diǎn)和基因型統(tǒng)計(jì)分析。并結(jié)合基因-AIS臨床表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)處理

通過卡方檢驗(yàn) (χ2檢驗(yàn)，SPSS13.0)證實(shí)病例組和對(duì)照組的年齡 (P=0.306)和性別 (P=1.000)的構(gòu)成比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

按PUMC分型將病例組107例患者分為Ⅰ組(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ組 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ組 (PUMCⅢ型)9例。按照側(cè)凸頂點(diǎn)位于T2～T11、12椎間隙為胸彎;側(cè)凸頂點(diǎn)位于T12～L1為胸腰彎;側(cè)凸頂點(diǎn)位于L1、2椎間隙～L4、5椎間隙為腰彎。107例AIS組患者按照側(cè)主彎凸頂點(diǎn)位置分為胸彎組66例，胸腰彎組10例，腰彎組31例。

2.2 Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)

Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示，病例組和對(duì)照組中檢測(cè)的各種基因型頻數(shù)均符合H-W平衡，說明樣本選擇在人群中具有代表性。

表2 基因型Hardy-Weinberg平衡的擬合優(yōu)度χ2 檢驗(yàn)

2.3 基于等位基因的“病例-對(duì)照”關(guān)聯(lián)分析

從表3中可以看出，陽性 (P＜0.05)位點(diǎn)位于編號(hào)SNP3的rs10153674(P=0.003)。具體分析可以得出，rs10153674(SNP3)等位基因 G，與AIS的易感性升高相關(guān)。

2.4 基于基因型的“病例-對(duì)照”關(guān)聯(lián)分析

從表4中可以看出，陽性 (P＜0.05)位點(diǎn)位于編號(hào)SNP3的rs10153674(P=0.003)。具體分析可以得出，rs10153674(SNP3)等位基因型G/G，與AIS的易感性升高相關(guān)。

在表3和表4的基礎(chǔ)上，對(duì)病例-對(duì)照組中基因頻率或基因型有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的位點(diǎn)，利用在線的SNPstats軟件，進(jìn)行非條件Logistic回歸模型分析。軟件根據(jù)五種遺傳學(xué)模型 (Codominant、Dominant、Recessive、Overdominant和Log-additive)的特點(diǎn)進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果見表5，AIC和BIC值越小說明模型越精確。因此rs10153674(SNP3)位點(diǎn)可能以Dominant遺傳模型的方式與AIS的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

2.5 基因型多態(tài)性與PUMC分型的關(guān)聯(lián)分析

按PUMC分型將病例組107例患者分為Ⅰ組(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ組 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ組 (PUMCⅢ型)9例。分別進(jìn)行三組與對(duì)照組以及三組間SNP位點(diǎn)等位基因多態(tài)性分布頻率比較。由表6結(jié)果可見，CALM2基因rs10153674和rs1027478位點(diǎn)在PUMC I型和對(duì)照組中的分布頻率統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異 (P=0.038和P=0.006)，進(jìn)一步分析得知 rs10153674基因型 G/G、rs1027478基因型A/G與PUMC I型的發(fā)生有關(guān)。

表3 病例組和對(duì)照組SNP位點(diǎn)等位基因頻率的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

表6 PUMCⅠ型組與對(duì)照組SNPs基因型多態(tài)性分析

3 討論

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸的具體發(fā)病原因目前尚不確定，但隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，更多的學(xué)者傾向于認(rèn)為該病是個(gè)多基因相關(guān)的遺傳疾病，其具體遺傳模式仍未確定。

早在1979年，Yarom等[6]發(fā)現(xiàn)AIS患者椎旁肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升，同時(shí)出現(xiàn)肌球蛋白的變性，與肌球蛋白異常相應(yīng)的血小板中Ca2+濃度亦上升，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。他們認(rèn)為AIS患者可能存在廣泛的細(xì)胞膜受損，因而出現(xiàn)椎旁肌以外的肌肉出現(xiàn)肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高。Machida等[7]認(rèn)為這種細(xì)胞膜的缺損會(huì)引起脊柱生長(zhǎng)失調(diào)，從而導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的發(fā)生。Cohen等[8]報(bào)道AIS患者血小板CaM含量是正常人群的2.5～3倍，并與脊柱側(cè)凸嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Kindsfate[9]和 Lowe[10]等研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)展性脊柱側(cè)凸患者 (＞10度/年)與穩(wěn)定性脊柱側(cè)凸患者 (＜10度/年=相比，其血小板中CaM含量明顯增高。國(guó)內(nèi)，邱貴興等[11，12]的系列研究發(fā)現(xiàn)AIS患者椎旁肌組織、關(guān)節(jié)突骨組織中鈣調(diào)蛋白表達(dá)升高。

Benitez等[16]發(fā)現(xiàn)褪黑素的生理功能與鈣調(diào)蛋白密切相關(guān)，并提出褪黑素和鈣調(diào)蛋白相互作用學(xué)說，認(rèn)為褪黑素與CaM動(dòng)態(tài)結(jié)合后即被激活。褪黑素和CaM的結(jié)合具有強(qiáng)親和性、可飽和性、可逆性、Ca2依賴性和配體選擇性，結(jié)合以后的CaM幾乎所有結(jié)構(gòu)域都與褪黑素結(jié)合，故不會(huì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

總之，CaM與AIS關(guān)系密切，但其作用機(jī)制尚不明確。因此我們考慮，鈣調(diào)蛋白的編碼基因很可能是參與AIS發(fā)病的多個(gè)相關(guān)基因中的一個(gè)。邱貴興等[13]的系列研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CALM1基因的多態(tài)性可能和特發(fā)性脊柱側(cè)凸小同臨床亞型相關(guān)聯(lián)。本研究采用了全新的微珠芯片技術(shù) (BeadArray)SNP檢測(cè)方法，對(duì)CALM2基因的SNPs進(jìn)行了檢測(cè)，并取得了陽性發(fā)現(xiàn)。

SNPs分為兩種:一種是位于基因編碼區(qū)內(nèi)(Coding region)的SNP，稱為cSNP.cSNP又分為同義SNP(Synonymous SNP)和錯(cuò)義SNP(Missense SNP)兩種。前者所致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，而后者堿基序列的改變可使翻譯后的氨基酸序列發(fā)生改變，從而可能影響蛋白質(zhì)的功能。另一種是位于基因組非編碼區(qū)的SNP。這些SNP分布于內(nèi)含子、5'-非翻譯區(qū)(Untransltion region，UTR)，3'-UTR及其它區(qū)域。位于5'-UTR區(qū)域的SNP可能參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，位于3'-UTR區(qū)域的SNP可能影響mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過程，位于內(nèi)含子的SNP可能影響mRNA前體的剪接。這些位于編碼區(qū)和調(diào)控序列中的SNP可能引起蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)或量的變化，可能與致病相關(guān)，常被稱為“功能多態(tài)性”(Functionalpolymorphism)[17]。 rs10153674 位 于CALM2基因的內(nèi)含子1區(qū)，rs1027478位于內(nèi)含子2區(qū)。目前尚沒有文獻(xiàn)對(duì)這兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的具體功能進(jìn)行研究。

一般存在遺傳標(biāo)記位點(diǎn)和疾病關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象可歸納為兩種情況:一種是遺傳標(biāo)記本身與疾病的病理發(fā)生有關(guān);另一種是致病位點(diǎn)與遺傳標(biāo)記位點(diǎn)存在很強(qiáng)的連鎖不平衡[18]。由此，我們推測(cè)這三個(gè)SNPs位點(diǎn)可能與疾病的病理發(fā)生無關(guān)，而是與某一致病基因位點(diǎn)存在很強(qiáng)的連鎖不平衡。我們推測(cè)這三個(gè)位點(diǎn)堿基的改變可能影響CALM2基因轉(zhuǎn)錄翻譯到CaM過程中的mRNA前體的剪切，使CaM的表達(dá)量上升，進(jìn)而導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的發(fā)生。

AIS臨床表現(xiàn)復(fù)雜，且其作為一種多因素影響疾病，不同的主效、微效基因可能決定不同的臨床特征，所以結(jié)合AIS臨床表型特征進(jìn)一步分析。按照PUMC分型理論[14]，AIS根據(jù)側(cè)凸的數(shù)量分為單彎、雙彎、三彎，分別為PUMCⅠ、Ⅱ、Ⅲ型。按照現(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為AIS是多基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，但究竟遺傳學(xué)因素對(duì)于雙彎或三彎的發(fā)生起到何種作用，是直接激發(fā)雙彎或三彎，還是直接激發(fā)單發(fā)，然后在環(huán)境因素的作用下繼發(fā)次彎，還是這二者兼而有之，這是目前困擾我們的難題，也正是我們按照不同臨床分析進(jìn)行遺傳學(xué)病因機(jī)制研究的目的。本組研究中證實(shí)PUMC I型AIS可能與CALM2基因rs10153674和rs1027478位點(diǎn)基因型多態(tài)性有關(guān)。我們據(jù)此推測(cè):AIS不同的臨床表型可能和不同的SNP位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)，而AIS的PUMC分型可能和不同的SNP位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)，提示PUMC分型不僅是指導(dǎo)臨床治療的可靠標(biāo)準(zhǔn)，而且可能是符合遺傳病因?qū)W機(jī)制的合理分型，但這需要擴(kuò)大樣本量、全面分析候選基因SNPs位點(diǎn)后進(jìn)一步研究證實(shí)。

AIS作為多基因遺傳疾病，一個(gè)或多個(gè)基因?qū)е虏煌谋硇停魏我粋€(gè)基因均可能使患者處于易感狀態(tài)，年齡、性別、環(huán)境因素的影響使基因表型趨于復(fù)雜化，只有證實(shí)控制多樣表型基因范圍的存在，才能進(jìn)一步確定畸形相關(guān)基因。從基因水平探索引起AIS的病因是一個(gè)有意義的方向，合理應(yīng)用連鎖分析的研究成果，選擇大量無親緣關(guān)系的散發(fā)個(gè)體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，有助于發(fā)現(xiàn)易感基因的精確位點(diǎn)。從基因水平上研究AIS的病因，探索和發(fā)現(xiàn)人類AIS的易感基因并進(jìn)一步通過前瞻性隊(duì)列研究實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，設(shè)計(jì)出用于診斷的基因芯片或標(biāo)記物，有助于提高孕期早期診斷AIS的水平，為優(yōu)生優(yōu)育作貢獻(xiàn)。

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