• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CALM2基因多態(tài)性與青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究*

    2011-09-13 00:45:20邱貴興吳志宏原所茂
    關(guān)鍵詞:特發(fā)性分型多態(tài)性

    周 熹 邱貴興 吳志宏 原所茂 費(fèi) 琦 劉 正

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科,北京100730)

    青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸 (adolescent idiopathic scoliosis,AIS)的發(fā)病原因及具體機(jī)制尚不清楚,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其可能是多基因遺傳病[1-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道鈣調(diào)蛋白水平增高和進(jìn)展性AIS之間有一定關(guān)聯(lián)意義[6-12],也有研究顯示鈣調(diào)蛋白 1基因(CALM1基因)的多態(tài)性與AIS不同亞型有一定聯(lián)系[13]。與 CALM1基因一樣,鈣調(diào)蛋白 2基因(CALM2基因)同樣參與鈣調(diào)蛋白合成表達(dá),本研究選擇CALM2基因?yàn)榭疾鞂?duì)象,研究其多態(tài)性與AIS的遺傳易感性之間的關(guān)系,并且對(duì)不同基因表型對(duì)AIS臨床亞型之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析探討。

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    采用“病例-對(duì)照”研究方法,研究對(duì)象為中國(guó)漢族人群,包括散發(fā)性青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸病例組和正常對(duì)照組。病例組來自2005年10月至2008年2月北京協(xié)和醫(yī)院脊柱外科病房住院的中國(guó)漢族AIS患者 (Cobb角≥30°),男17例,女90例,年齡范圍10~22歲,平均15.53±2.18歲。所有患者通過臨床和影像學(xué)確診,排除其它類型的脊柱側(cè)凸。分別記錄所有患者PUMC分型[14]資料、側(cè)凸頂點(diǎn)位置以及Cobb角。對(duì)照組來自同期北京協(xié)和醫(yī)院就診的外傷、感染患者及健康查體者,排除脊柱側(cè)凸家族史和病史。對(duì)照組男17例,女90例,年齡范圍10~20歲,平均15.12±2.59歲。所有研究對(duì)象和其家長(zhǎng)簽署知情同意書,并獲得中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 SNP(single nucleotide polymorphyism,單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)選擇 在美國(guó)NCBI-SNPs數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)和歐洲Ensembl-SNPs數(shù)據(jù)庫 (http://www.ensembl.org/index.html)中,查找 CALM2基因的已知SNPs。根據(jù)國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃 (http://www.Hapmap.org)提供的基因型數(shù)據(jù),優(yōu)先選取雜合度高于10%,位于外顯子區(qū)域或有錯(cuò)義突變的SNPs和位于3'-、5'-調(diào)控區(qū)的SNPs作為遺傳標(biāo)記,共選取8個(gè)SNPs,具體見表1。

    表1 篩查的SNPs

    1.2.2 提取DNA 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司),根據(jù)它的Spin柱方案從外周全血中進(jìn)行DNA的提取,并用分光光度法對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定,最終提取DNA濃度約為25 ng/Ixl。

    1.2.3 DNA濃度測(cè)定和濃縮純化 VeraCode GoldenGate Genotyping Assay檢測(cè)SNPs所需的最佳濃度為50~100 ng/μl,較提取濃度高,因此采用離心重溶解的方式進(jìn)行濃縮純化,達(dá)到要求濃度。

    1.2.4 SNPs檢測(cè) 采用的VeraCode GoldenGate Genotyping Assay:96&384-plex系統(tǒng) (Illumina公司)進(jìn)行SNPs檢測(cè)。該系統(tǒng)采用光纖微珠芯片平臺(tái)進(jìn)行基因分型,得到SNP位點(diǎn)信息。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

    應(yīng)用SNPstats軟件 (Availability:http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)[15]、 SAS 8.2 軟 件、Haploview 4.0(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)等統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,進(jìn)行基因型頻率分布的Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn),單位點(diǎn)和基因型統(tǒng)計(jì)分析。并結(jié)合基因-AIS臨床表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)處理

    通過卡方檢驗(yàn) (χ2檢驗(yàn),SPSS13.0)證實(shí)病例組和對(duì)照組的年齡 (P=0.306)和性別 (P=1.000)的構(gòu)成比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    按PUMC分型將病例組107例患者分為Ⅰ組(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ組 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ組 (PUMCⅢ型)9例。按照側(cè)凸頂點(diǎn)位于T2~T11、12椎間隙為胸彎;側(cè)凸頂點(diǎn)位于T12~L1為胸腰彎;側(cè)凸頂點(diǎn)位于L1、2椎間隙~L4、5椎間隙為腰彎。107例AIS組患者按照側(cè)主彎凸頂點(diǎn)位置分為胸彎組66例,胸腰彎組10例,腰彎組31例。

    2.2 Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)

    Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果如表2所示,病例組和對(duì)照組中檢測(cè)的各種基因型頻數(shù)均符合H-W平衡,說明樣本選擇在人群中具有代表性。

    表2 基因型Hardy-Weinberg平衡的擬合優(yōu)度χ2 檢驗(yàn)

    2.3 基于等位基因的“病例-對(duì)照”關(guān)聯(lián)分析

    從表3中可以看出,陽性 (P<0.05)位點(diǎn)位于編號(hào)SNP3的rs10153674(P=0.003)。具體分析可以得出,rs10153674(SNP3)等位基因 G,與AIS的易感性升高相關(guān)。

    2.4 基于基因型的“病例-對(duì)照”關(guān)聯(lián)分析

    從表4中可以看出,陽性 (P<0.05)位點(diǎn)位于編號(hào)SNP3的rs10153674(P=0.003)。具體分析可以得出,rs10153674(SNP3)等位基因型G/G,與AIS的易感性升高相關(guān)。

    在表3和表4的基礎(chǔ)上,對(duì)病例-對(duì)照組中基因頻率或基因型有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的位點(diǎn),利用在線的SNPstats軟件,進(jìn)行非條件Logistic回歸模型分析。軟件根據(jù)五種遺傳學(xué)模型 (Codominant、Dominant、Recessive、Overdominant和Log-additive)的特點(diǎn)進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果見表5,AIC和BIC值越小說明模型越精確。因此rs10153674(SNP3)位點(diǎn)可能以Dominant遺傳模型的方式與AIS的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

    2.5 基因型多態(tài)性與PUMC分型的關(guān)聯(lián)分析

    按PUMC分型將病例組107例患者分為Ⅰ組(PUMCⅠ型)22例、Ⅱ組 (PUMCⅡ型)76例、Ⅲ組 (PUMCⅢ型)9例。分別進(jìn)行三組與對(duì)照組以及三組間SNP位點(diǎn)等位基因多態(tài)性分布頻率比較。由表6結(jié)果可見,CALM2基因rs10153674和rs1027478位點(diǎn)在PUMC I型和對(duì)照組中的分布頻率統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異 (P=0.038和P=0.006),進(jìn)一步分析得知 rs10153674基因型 G/G、rs1027478基因型A/G與PUMC I型的發(fā)生有關(guān)。

    表3 病例組和對(duì)照組SNP位點(diǎn)等位基因頻率的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

    表6 PUMCⅠ型組與對(duì)照組SNPs基因型多態(tài)性分析

    3 討論

    青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸的具體發(fā)病原因目前尚不確定,但隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展,更多的學(xué)者傾向于認(rèn)為該病是個(gè)多基因相關(guān)的遺傳疾病,其具體遺傳模式仍未確定。

    早在1979年,Yarom等[6]發(fā)現(xiàn)AIS患者椎旁肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升,同時(shí)出現(xiàn)肌球蛋白的變性,與肌球蛋白異常相應(yīng)的血小板中Ca2+濃度亦上升,導(dǎo)致Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。他們認(rèn)為AIS患者可能存在廣泛的細(xì)胞膜受損,因而出現(xiàn)椎旁肌以外的肌肉出現(xiàn)肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高。Machida等[7]認(rèn)為這種細(xì)胞膜的缺損會(huì)引起脊柱生長(zhǎng)失調(diào),從而導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的發(fā)生。Cohen等[8]報(bào)道AIS患者血小板CaM含量是正常人群的2.5~3倍,并與脊柱側(cè)凸嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Kindsfate[9]和 Lowe[10]等研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)展性脊柱側(cè)凸患者 (>10度/年)與穩(wěn)定性脊柱側(cè)凸患者 (<10度/年=相比,其血小板中CaM含量明顯增高。國(guó)內(nèi),邱貴興等[11,12]的系列研究發(fā)現(xiàn)AIS患者椎旁肌組織、關(guān)節(jié)突骨組織中鈣調(diào)蛋白表達(dá)升高。

    Benitez等[16]發(fā)現(xiàn)褪黑素的生理功能與鈣調(diào)蛋白密切相關(guān),并提出褪黑素和鈣調(diào)蛋白相互作用學(xué)說,認(rèn)為褪黑素與CaM動(dòng)態(tài)結(jié)合后即被激活。褪黑素和CaM的結(jié)合具有強(qiáng)親和性、可飽和性、可逆性、Ca2依賴性和配體選擇性,結(jié)合以后的CaM幾乎所有結(jié)構(gòu)域都與褪黑素結(jié)合,故不會(huì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

    總之,CaM與AIS關(guān)系密切,但其作用機(jī)制尚不明確。因此我們考慮,鈣調(diào)蛋白的編碼基因很可能是參與AIS發(fā)病的多個(gè)相關(guān)基因中的一個(gè)。邱貴興等[13]的系列研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CALM1基因的多態(tài)性可能和特發(fā)性脊柱側(cè)凸小同臨床亞型相關(guān)聯(lián)。本研究采用了全新的微珠芯片技術(shù) (BeadArray)SNP檢測(cè)方法,對(duì)CALM2基因的SNPs進(jìn)行了檢測(cè),并取得了陽性發(fā)現(xiàn)。

    SNPs分為兩種:一種是位于基因編碼區(qū)內(nèi)(Coding region)的SNP,稱為cSNP.cSNP又分為同義SNP(Synonymous SNP)和錯(cuò)義SNP(Missense SNP)兩種。前者所致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列,而后者堿基序列的改變可使翻譯后的氨基酸序列發(fā)生改變,從而可能影響蛋白質(zhì)的功能。另一種是位于基因組非編碼區(qū)的SNP。這些SNP分布于內(nèi)含子、5'-非翻譯區(qū)(Untransltion region,UTR),3'-UTR及其它區(qū)域。位于5'-UTR區(qū)域的SNP可能參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,位于3'-UTR區(qū)域的SNP可能影響mRNA的穩(wěn)定性及翻譯過程,位于內(nèi)含子的SNP可能影響mRNA前體的剪接。這些位于編碼區(qū)和調(diào)控序列中的SNP可能引起蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)或量的變化,可能與致病相關(guān),常被稱為“功能多態(tài)性”(Functionalpolymorphism)[17]。 rs10153674 位 于CALM2基因的內(nèi)含子1區(qū),rs1027478位于內(nèi)含子2區(qū)。目前尚沒有文獻(xiàn)對(duì)這兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的具體功能進(jìn)行研究。

    一般存在遺傳標(biāo)記位點(diǎn)和疾病關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象可歸納為兩種情況:一種是遺傳標(biāo)記本身與疾病的病理發(fā)生有關(guān);另一種是致病位點(diǎn)與遺傳標(biāo)記位點(diǎn)存在很強(qiáng)的連鎖不平衡[18]。由此,我們推測(cè)這三個(gè)SNPs位點(diǎn)可能與疾病的病理發(fā)生無關(guān),而是與某一致病基因位點(diǎn)存在很強(qiáng)的連鎖不平衡。我們推測(cè)這三個(gè)位點(diǎn)堿基的改變可能影響CALM2基因轉(zhuǎn)錄翻譯到CaM過程中的mRNA前體的剪切,使CaM的表達(dá)量上升,進(jìn)而導(dǎo)致脊柱側(cè)凸的發(fā)生。

    AIS臨床表現(xiàn)復(fù)雜,且其作為一種多因素影響疾病,不同的主效、微效基因可能決定不同的臨床特征,所以結(jié)合AIS臨床表型特征進(jìn)一步分析。按照PUMC分型理論[14],AIS根據(jù)側(cè)凸的數(shù)量分為單彎、雙彎、三彎,分別為PUMCⅠ、Ⅱ、Ⅲ型。按照現(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為AIS是多基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,但究竟遺傳學(xué)因素對(duì)于雙彎或三彎的發(fā)生起到何種作用,是直接激發(fā)雙彎或三彎,還是直接激發(fā)單發(fā),然后在環(huán)境因素的作用下繼發(fā)次彎,還是這二者兼而有之,這是目前困擾我們的難題,也正是我們按照不同臨床分析進(jìn)行遺傳學(xué)病因機(jī)制研究的目的。本組研究中證實(shí)PUMC I型AIS可能與CALM2基因rs10153674和rs1027478位點(diǎn)基因型多態(tài)性有關(guān)。我們據(jù)此推測(cè):AIS不同的臨床表型可能和不同的SNP位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān),而AIS的PUMC分型可能和不同的SNP位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān),提示PUMC分型不僅是指導(dǎo)臨床治療的可靠標(biāo)準(zhǔn),而且可能是符合遺傳病因?qū)W機(jī)制的合理分型,但這需要擴(kuò)大樣本量、全面分析候選基因SNPs位點(diǎn)后進(jìn)一步研究證實(shí)。

    AIS作為多基因遺傳疾病,一個(gè)或多個(gè)基因?qū)е虏煌谋硇停魏我粋€(gè)基因均可能使患者處于易感狀態(tài),年齡、性別、環(huán)境因素的影響使基因表型趨于復(fù)雜化,只有證實(shí)控制多樣表型基因范圍的存在,才能進(jìn)一步確定畸形相關(guān)基因。從基因水平探索引起AIS的病因是一個(gè)有意義的方向,合理應(yīng)用連鎖分析的研究成果,選擇大量無親緣關(guān)系的散發(fā)個(gè)體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,有助于發(fā)現(xiàn)易感基因的精確位點(diǎn)。從基因水平上研究AIS的病因,探索和發(fā)現(xiàn)人類AIS的易感基因并進(jìn)一步通過前瞻性隊(duì)列研究實(shí)驗(yàn)來證實(shí),設(shè)計(jì)出用于診斷的基因芯片或標(biāo)記物,有助于提高孕期早期診斷AIS的水平,為優(yōu)生優(yōu)育作貢獻(xiàn)。

    [1]Wynne R.A genetic survey of idiopathic scoliosis in Boston,Massachusetts.J Bone Joint Surg Am,1973,55:974-982.

    [2]Machida M.Cause of idiopathic scoliosis.Spine,1999,24(24):2576-2583.

    [3]Damborg F,Engell V.The Genetics of AIS:A Twin Study.Proceedings of the 39th Annal SRS& Course,California.2004.

    [4]Ogilvie JW,Braun J,Argyle V,et al.The search for idiopathic scoliosis genes.Spine,2006,31(6):679-681.

    [5]Cowell HR,Hall JN,MacEwen GD.Genetic aspects of idiopathic scoliosis.Clin Orthop,1972,86:121-131.

    [6]Yarom R,Robin GC.Studies on spinal and peripheral muscles from patients with scoliosis.Spine,1979,4(1):12-21.

    [7]Machida M,Dubousset J,Imamura Y,et al.An experimental study in chickens for the pathogenesis of idiopathic scoliosis.Spine,1993,18(12):1609-1615.

    [8]Cohen DS,Solomons CS,Lowe TG.Altered platelet calmodulin activity in idiopathic scoliosis.Orthop Trans,1985,9:106.

    [9]Kindsfater K,Lowe T,Lawellin D,et al.Levels of platelet calmodulin for the prediction of progression and severity of adolescent idiopathic scoliosis. JBone JointSurg Am,1994,76 (8):1186-1192.

    [10]Lowe T,Lawellin D,Smith D,et al.Platelet calmodulin levels in adolescent idiopathic scoliosis:do the levels correlate with curve progression and severity?Spine,2002,27(7):768-775.

    [11]趙宇,邱貴興.特發(fā)性脊柱側(cè)凸椎旁肌組織鈣調(diào)蛋白和神經(jīng)元型一氧化氮合酶表達(dá)的研究.中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(16):1358-1360.

    [12]邱貴興,李婧,劉勇,等.鈣調(diào)蛋白在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者關(guān)節(jié)突組織中的表達(dá).中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(29):2017-2019.

    [13]趙棟,邱貴興,王以朋,等.鈣調(diào)蛋白1基因多態(tài)性和青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸不同亞型的關(guān)系.中華骨科雜志,2008,28(6):475-479.

    [14]邱貴興,仉建國(guó),王以朋,等.特發(fā)性脊柱側(cè)凸的PUMC(協(xié)和)分型系統(tǒng).中華骨科雜志,2003,23(1):1-9.

    [15]Sole X,Guino E,Valls J,et a1.SNPStats:a web tool for the analysis of association studies.Bioinformatics,2006,22(15):1928-1929.

    [16]Benítez KG,Ríos A,Martínez A,et al.In vitro inhibition of Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡactivity by melatonin.Biochim Biophys Acta,1996,1290(2):191-196.

    [17]Daly MJ,Rioux JD,Schaffner SF,et al.High-resolution haplotype structure in the human genome.Nat Genet,2001,29(2):229-232.

    [18]Yahata T,Quan J,Tamura N,et al.Association between single nucleotide polymorphisms of estrogen receptor:gene and efficacy of HRT on bone mineral density in post-menopausal Japanese women.Hum Reprod,2005,20(7):1860-1866.

    猜你喜歡
    特發(fā)性分型多態(tài)性
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進(jìn)展
    失眠可調(diào)養(yǎng),食補(bǔ)需分型
    特發(fā)性肺纖維化合并肺癌
    便秘有多種 治療須分型
    特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化中醫(yī)治療探賾
    馬鈴薯cpDNA/mtDNA多態(tài)性的多重PCR檢測(cè)
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
    基于分型線驅(qū)動(dòng)的分型面設(shè)計(jì)研究
    特發(fā)性矮小患兒血中p53及p21waf/cip1的表達(dá)
    頸椎病中醫(yī)辨證分型與影像探討
    aaaaa片日本免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 性少妇av在线| 国产不卡av网站在线观看| 下体分泌物呈黄色| 国产熟女午夜一区二区三区| 天堂动漫精品| 一级毛片女人18水好多| 成人18禁在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久人人97超碰香蕉20202| 天堂俺去俺来也www色官网| 蜜桃国产av成人99| 日本黄色视频三级网站网址 | 黄色成人免费大全| 操美女的视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲中文字幕日韩| 99国产精品一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| av网站免费在线观看视频| 国产黄频视频在线观看| 青草久久国产| 宅男免费午夜| 交换朋友夫妻互换小说| 十八禁人妻一区二区| 69精品国产乱码久久久| aaaaa片日本免费| 欧美成人免费av一区二区三区 | 黄色视频不卡| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲精品美女久久av网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 日韩一区二区三区影片| 又紧又爽又黄一区二区| 超碰97精品在线观看| 丝袜在线中文字幕| 国产真人三级小视频在线观看| 天堂动漫精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美乱妇无乱码| 久久久国产一区二区| 国产片内射在线| 午夜91福利影院| 亚洲欧美激情在线| 91成人精品电影| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品九九99| 一级,二级,三级黄色视频| av片东京热男人的天堂| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲av成人一区二区三| 色尼玛亚洲综合影院| 视频区图区小说| 电影成人av| 国产精品.久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人av一区二区三区在线看| www日本在线高清视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产亚洲av高清不卡| 国产日韩欧美视频二区| 999久久久国产精品视频| 国产xxxxx性猛交| 亚洲,欧美精品.| videosex国产| 久久久久久久久久久久大奶| 后天国语完整版免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费av中文字幕在线| 国精品久久久久久国模美| 美国免费a级毛片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 又大又爽又粗| 99久久国产精品久久久| 99精品在免费线老司机午夜| 激情在线观看视频在线高清 | 午夜两性在线视频| 9热在线视频观看99| 激情视频va一区二区三区| 久久狼人影院| 国产欧美亚洲国产| 国产成人精品无人区| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 超碰成人久久| 岛国在线观看网站| 国产精品国产高清国产av | 亚洲专区字幕在线| 看免费av毛片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| xxxhd国产人妻xxx| 老司机亚洲免费影院| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 精品一品国产午夜福利视频| 岛国毛片在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲情色 制服丝袜| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| a级毛片黄视频| 成人av一区二区三区在线看| h视频一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 黄频高清免费视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲人成电影免费在线| 热99re8久久精品国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲,欧美精品.| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 国产精品偷伦视频观看了| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 精品久久久久久电影网| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产欧美日韩一区二区三| 成年人黄色毛片网站| 久久 成人 亚洲| 91成人精品电影| 久久久久久久久久久久大奶| 国产成人av激情在线播放| 嫩草影视91久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人啪精品午夜网站| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美激情在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日韩中文字幕视频在线看片| 黄色成人免费大全| 国产成人精品在线电影| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 手机成人av网站| 亚洲第一青青草原| 女人精品久久久久毛片| 国产日韩欧美视频二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲黑人精品在线| 丁香六月欧美| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩三级视频一区二区三区| 大码成人一级视频| 久久久久久人人人人人| 51午夜福利影视在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费黄频网站在线观看国产| 国产av又大| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲第一av免费看| 中文字幕人妻熟女乱码| 久热爱精品视频在线9| www.999成人在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 99九九在线精品视频| 精品一品国产午夜福利视频| 国产麻豆69| www日本在线高清视频| 亚洲av美国av| 性少妇av在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品一区二区在线观看99| 午夜激情久久久久久久| 亚洲全国av大片| 大型av网站在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产不卡一卡二| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品免费一区二区三区在线 | 最黄视频免费看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线观看免费午夜福利视频| 国产1区2区3区精品| 一区二区三区激情视频| 国产欧美日韩一区二区三| 天天操日日干夜夜撸| 69精品国产乱码久久久| 成年人黄色毛片网站| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲色图综合在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日本wwww免费看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 757午夜福利合集在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 91成人精品电影| 18在线观看网站| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久这里只有精品19| 老司机亚洲免费影院| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 99热网站在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 这个男人来自地球电影免费观看| 人人澡人人妻人| 在线观看人妻少妇| bbb黄色大片| 黄色成人免费大全| 在线天堂中文资源库| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产午夜精品久久久久久| 亚洲天堂av无毛| 操美女的视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲av第一区精品v没综合| 91大片在线观看| av天堂在线播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 激情在线观看视频在线高清 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 不卡一级毛片| 日韩人妻精品一区2区三区| 日本av手机在线免费观看| 好男人电影高清在线观看| 国产精品av久久久久免费| 99久久国产精品久久久| 91九色精品人成在线观看| 悠悠久久av| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 高清在线国产一区| 久久久精品区二区三区| 午夜福利,免费看| 亚洲熟女精品中文字幕| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 99re在线观看精品视频| 99热国产这里只有精品6| 欧美日韩av久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产人伦9x9x在线观看| av欧美777| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一级a爱视频在线免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 天堂8中文在线网| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲国产av新网站| 三上悠亚av全集在线观看| 1024视频免费在线观看| 在线 av 中文字幕| 久久精品人人爽人人爽视色| 少妇的丰满在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲精华国产精华精| 国产激情久久老熟女| 水蜜桃什么品种好| 美女午夜性视频免费| 日韩大码丰满熟妇| 午夜免费鲁丝| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 99热国产这里只有精品6| 日韩一区二区三区影片| 免费看十八禁软件| 亚洲专区国产一区二区| 久久亚洲真实| 成年人午夜在线观看视频| 天天添夜夜摸| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 欧美精品一区二区免费开放| 女同久久另类99精品国产91| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产不卡av网站在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 欧美午夜高清在线| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 亚洲 国产 在线| 欧美乱妇无乱码| 少妇 在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 精品国产国语对白av| 国产欧美亚洲国产| 日日夜夜操网爽| 欧美激情 高清一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲 国产 在线| 麻豆国产av国片精品| 色播在线永久视频| av视频免费观看在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产视频一区二区在线看| 亚洲熟妇熟女久久| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲中文av在线| 我的亚洲天堂| 久久久久精品人妻al黑| av国产精品久久久久影院| 国产伦理片在线播放av一区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 深夜精品福利| 黄色a级毛片大全视频| 18禁国产床啪视频网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 另类亚洲欧美激情| 成人影院久久| 18禁国产床啪视频网站| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲,欧美精品.| 成人影院久久| 亚洲男人天堂网一区| 在线播放国产精品三级| av视频免费观看在线观看| 国产精品免费大片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品人妻在线不人妻| 亚洲avbb在线观看| av欧美777| 人妻久久中文字幕网| tube8黄色片| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜精品久久久久久毛片777| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜福利在线观看吧| 下体分泌物呈黄色| 男女边摸边吃奶| 亚洲色图av天堂| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美日韩av久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲精品美女久久av网站| 我的亚洲天堂| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 色视频在线一区二区三区| 人妻一区二区av| 欧美久久黑人一区二区| 一二三四社区在线视频社区8| 成人影院久久| 91精品三级在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日韩视频在线欧美| 国产精品免费大片| 国产精品国产av在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 精品一品国产午夜福利视频| 国产高清videossex| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美国产精品一级二级三级| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美中文综合在线视频| 久久久欧美国产精品| 三级毛片av免费| 亚洲 国产 在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 色在线成人网| 大码成人一级视频| 人妻 亚洲 视频| 高清在线国产一区| 高清视频免费观看一区二区| 丁香六月欧美| 极品教师在线免费播放| 女性被躁到高潮视频| 免费观看av网站的网址| 曰老女人黄片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 青草久久国产| 大型黄色视频在线免费观看| 在线av久久热| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 人人澡人人妻人| 欧美日本中文国产一区发布| 精品高清国产在线一区| 香蕉丝袜av| av不卡在线播放| 精品福利永久在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线观看www视频免费| 香蕉国产在线看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产麻豆69| 丝袜喷水一区| 亚洲欧洲日产国产| 18禁国产床啪视频网站| 怎么达到女性高潮| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲三区欧美一区| 最黄视频免费看| 好男人电影高清在线观看| 三级毛片av免费| 韩国精品一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 在线av久久热| 人妻 亚洲 视频| 久久热在线av| 女性生殖器流出的白浆| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久久久久久久久久大奶| 999久久久精品免费观看国产| 免费观看a级毛片全部| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 中文字幕色久视频| 国产真人三级小视频在线观看| svipshipincom国产片| 欧美黄色片欧美黄色片| 淫妇啪啪啪对白视频| 成年人免费黄色播放视频| 中文字幕高清在线视频| 老司机影院毛片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 成人免费观看视频高清| 美女福利国产在线| av有码第一页| 一级毛片精品| 一二三四社区在线视频社区8| 成人18禁在线播放| av线在线观看网站| 久久精品亚洲av国产电影网| 一本久久精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲中文日韩欧美视频| 视频区欧美日本亚洲| 一区二区三区国产精品乱码| 99国产精品免费福利视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久亚洲精品不卡| 日韩大片免费观看网站| 国产高清视频在线播放一区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 女人久久www免费人成看片| 精品国内亚洲2022精品成人 | 1024香蕉在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 三级毛片av免费| 97在线人人人人妻| 操出白浆在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产一区二区在线观看av| 国产精品影院久久| 日本vs欧美在线观看视频| 91字幕亚洲| 操美女的视频在线观看| 99久久人妻综合| bbb黄色大片| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品久久久久久电影网| 亚洲 国产 在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品成人在线| 妹子高潮喷水视频| 久9热在线精品视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| av福利片在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精华国产精华精| av免费在线观看网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 麻豆成人av在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 激情在线观看视频在线高清 | 久久九九热精品免费| 久久久精品区二区三区| 成人手机av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一区二区三区精品91| 国产精品久久久久久精品古装| 精品熟女少妇八av免费久了| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99久久国产精品久久久| 乱人伦中国视频| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲精华国产精华精| 一二三四在线观看免费中文在| 久久免费观看电影| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美日韩黄片免| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久9热在线精品视频| 不卡一级毛片| 后天国语完整版免费观看| 999精品在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 超碰97精品在线观看| 69精品国产乱码久久久| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久这里只有精品19| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产极品粉嫩免费观看在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产国语露脸激情在线看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中文字幕人妻熟女乱码| 12—13女人毛片做爰片一| 久9热在线精品视频| 男人舔女人的私密视频| 国产成人av教育| 免费看a级黄色片| 国产精品国产av在线观看| e午夜精品久久久久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| videos熟女内射| 成人国语在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 无人区码免费观看不卡 | 国产伦人伦偷精品视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产精品一区二区在线不卡| 深夜精品福利| 淫妇啪啪啪对白视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产区一区二久久| 午夜福利乱码中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成人永久免费在线观看视频 | 精品福利观看| 国产色视频综合| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 9色porny在线观看| 在线天堂中文资源库| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 极品人妻少妇av视频| 久久亚洲精品不卡| 怎么达到女性高潮| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久国产精品影院| 免费观看a级毛片全部| tube8黄色片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日韩免费高清中文字幕av| 1024视频免费在线观看| 老司机靠b影院| 国产单亲对白刺激| 精品乱码久久久久久99久播| 9191精品国产免费久久| 欧美在线一区亚洲| 亚洲三区欧美一区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产在线一区二区三区精| 日韩大片免费观看网站| 久久久精品免费免费高清| 黄色毛片三级朝国网站| 国产福利在线免费观看视频| 不卡一级毛片| 一进一出抽搐动态| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 伦理电影免费视频| 国产精品一区二区在线观看99| 黄色视频在线播放观看不卡| 中文欧美无线码| 91成人精品电影| 欧美久久黑人一区二区| 香蕉丝袜av| 精品国产亚洲在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 水蜜桃什么品种好| 99热国产这里只有精品6| 在线观看免费视频网站a站| 久久99热这里只频精品6学生|