不同濃度血管緊張素Ⅱ?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細胞衰老和P-選擇素表達的影響

王雪妮 劉凌 劉澤 王魯妮 吳軍 王偉 封菊香

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中最重要的活性物質(zhì)，它通過與受體相結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生理、病理作用，如血管平滑肌收縮、動脈血壓升高等，可繼發(fā)性引起動脈粥樣硬化。但有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能刺激血管自由基的產(chǎn)生，促進血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)和功能障礙，加速血管內(nèi)皮細胞衰老，參與動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的過程［1］，提示AngⅡ參與動脈粥樣硬化可能有另外其他的機制。P-選擇素屬于細胞黏附分子中的選擇素家族，是內(nèi)皮細胞損傷及血小板活化的特異性指標，可能參與動脈硬化的早期階段［2］。本研究以建立AngⅡ誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)衰老模型，觀察AngⅡ?qū)?nèi)皮細胞衰老及P-選擇素表達的影響，探討AngⅡ在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株HUVEC由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科提供;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HYCLONE公司;AngⅡ、CCK-8購自美國Sigma公司;Human's P-selectin Platinum ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司;細胞周期流式細胞分析試劑盒、細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶(β-gal)檢測試劑盒購自上海杰美公司;倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，酶標儀(Tecan Genios，瑞士)，流式細胞儀(Miltenyi公司，德國)。

1.2 HUVEC的培養(yǎng) HUVEC細胞株貼壁生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次維持細胞良好生長狀態(tài)。待細胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVEC呈多角形，單層鋪路石樣緊密排列。

1.3 不同濃度AngⅡ誘導(dǎo)HUVEC衰老 將細胞(2.5×104個/孔)接種于24孔板中，每孔加入普通全培養(yǎng)基1 ml培養(yǎng)過夜。隨機分為5組，分別為對照組及不同濃度AngⅡ組(10-8～10-5mmol/L)。待細胞長至亞融合時無血清培養(yǎng)12 h，使細胞達到同步化。棄去原培養(yǎng)液，對照組加入1 ml普通全培養(yǎng)液，藥物組分別加入1 ml含不同濃度AngⅡ的全培養(yǎng)基，持續(xù)刺激48 h，第12 h和24 h各補充1次AngⅡ，建立AngⅡ誘導(dǎo)的HUVEC衰老模型［3］。

1.4 β-gal檢測法檢測細胞衰老情況 根據(jù)細胞衰老特異性β-gal檢測試劑盒操作方法，將原培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液棄去，每孔加入500 μl清理液，清洗細胞表面，棄去清理液后加入500 μl固定液室溫下孵育5 min，抽去固定液，加入500 μl酸性液清洗細胞表面，再重復(fù)清洗1次后，每孔加入400 μl染色工作液，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下觀察和計數(shù)。

1.5 流式細胞術(shù)分析衰老細胞周期變化情況 依據(jù)細胞周期流式細胞分析試劑盒說明，用PBS沖洗細胞表面2次，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化收集約106個細胞，放入離心機離心5 min，速度為300 g;抽去上清液后，加入1號工作液500 μl輕輕混勻細胞，暗室里室溫下孵育60 min后，加入2號工作液500 μl混勻，過篩后立刻上機檢測進行細胞流式周期分析。

1.6 CCK-8法檢測細胞存活率 細胞以5000個/孔接種于96孔板中，按上述造模方法誘導(dǎo)細胞衰老后，向每孔加入CCK-820 μl培養(yǎng)1 h，酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm下測定各孔OD值，以藥物組與對照組OD值百分比代表細胞增殖率。每組設(shè)4復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.7 ELISA檢測培養(yǎng)基上清中P-選擇素含量 將細胞(2.5×104個/孔)接種于24孔板中，每孔加入普通全培養(yǎng)基1 ml培養(yǎng)過夜。隨機分為5組，分別為對照組及不同濃度AngⅡ組(10-8～10-5mmol/L)，按照上述方法誘導(dǎo)細胞衰老后，取細胞培養(yǎng)液上清離心，再收集上清置于-20℃保存，然后按Human's P-selectin Platinum ELISA試劑盒說明操作，置于酶標儀在450 nm處測定吸光度，每組設(shè)3復(fù)孔，重復(fù)2次。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示，計量資料比較采用單因素ANOVA(方差分析)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老相關(guān)β-gal活性 β-gal是一種鑒別細胞衰老的生物學標志［4］。β-gal染色結(jié)果顯示，不同濃度AngⅡ處理HUVEC 48 h后，對照組幾乎不表達β-gal(1.02±1.15)%，濃度為10-8～10-5mmol/L藥物組細胞β-gal染色陽性百分率分別為(25.94±2.58)%、(51.37±2.76)%、(79.80±2.83)%、(91.81±1.53)%，與對照組相比，細胞衰老的數(shù)量隨著AngⅡ濃度的增加逐漸增多(P均＜0.01)。

2.2 細胞周期分析 流式細胞儀分析顯示，HUVEC在不同濃度AngⅡ培養(yǎng)液中孵育48 h后，隨著AngⅡ濃度的升高，G0/G1期細胞百分率逐漸增多，S期細胞百分率逐漸減少。與對照組相比，10-8和10-7mmol/L AngⅡ組無明顯差異，10-6和10-5mmol/L AngⅡ組有統(tǒng)計學差異(表1)。

表1 不同濃度AngⅡ?qū)毎芷诘挠绊?±s，%)

表1 不同濃度AngⅡ?qū)毎芷诘挠绊?±s，%)

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 G0/G1期 S期對照組＊＊50.76±2.77 43.98±1.8310-8mmol/L組 53.58±2.25 38.64±1.6810-7mmol/L組 54.44±2.38 37.13±1.5210-6mmol/L組 58.26±2.89* 34.68±1.13*10-5mmol/L組 62.37±2.42＊＊ 29.15±1.95

2.3 細胞存活率變化情況 經(jīng)不同濃度AngⅡ培養(yǎng)48 h后，CCK-8法檢測表明藥物組存活細胞數(shù)與對照組相比明顯下降(P均＜0.01);并隨AngⅡ濃度增高，細胞存活率逐漸下降(圖1)。

圖1 不同濃度AngⅡ培養(yǎng)后存活細胞數(shù)

2.4 P-選擇素表達含量的變化 對照組的P-選擇素表達含量為(2.47±0.06)ng/ml，含不同濃度 AngⅡ(10-8～10-5mmol/L)組P-選擇素含量分別為(39.68±0.35)ng/ml、(41.70 ± 0.45)ng/ml、(71.25 ± 0.29)ng/ml、(79.89 ±0.28)ng/ml，與對照組相比，隨著 AngⅡ濃度的增加，P-選擇素表達含量明顯增多(P均＜0.01)。

3 討論

流行病學研究顯示，年齡是動脈粥樣硬化性疾病的主要危險因素之一，越來越多研究表明血管內(nèi)皮細胞衰老在動脈硬化疾病的發(fā)病中起著重要的作用，衰老的血管內(nèi)皮細胞會發(fā)生形態(tài)和功能上的變化，引起內(nèi)皮功能障礙及血管壁結(jié)構(gòu)的改變，血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［5］。有研究顯示，在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)檢測出較強的衰老相關(guān)β-gal活性，表明內(nèi)皮細胞衰老與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示AngⅡ不同濃度組內(nèi)皮細胞衰老相關(guān)β-gal活性與對照組相比明顯增高，且呈濃度依賴性;而細胞周期及存活率的變化隨著AngⅡ濃度的變化有逐漸降低的趨勢，提示AngⅡ可呈劑量依賴性直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老。

P-選擇素是一種存在于血小板a顆粒及內(nèi)皮細胞Weibel-Palade體中細胞表面黏附分子，它能夠介導(dǎo)白細胞和血小板在內(nèi)皮細胞上黏附、聚集、活化并釋放炎性遞質(zhì)，參與炎癥過程，可作為血小板活化和內(nèi)皮細胞功能受損的重要分子標志物。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ作用于內(nèi)皮細胞后能引起P-選擇素的表達。有研究顯示，P-選擇素可以直接作用于小鼠血管內(nèi)皮，引起炎癥反應(yīng)或血栓形成，導(dǎo)致血-腦屏障功能障礙及動脈粥樣硬化，最終導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生［6］。本實驗中AngⅡ不同濃度組的P-選擇素的表達與對照組相比明顯增加，并隨著AngⅡ濃度的增加，P-選擇素的表達逐漸增加，AngⅡ(10-5mmol/L)組作用于內(nèi)皮細胞后P-選擇素的表達達到高峰并維持在較高水平。這些結(jié)果提示AngⅡ可以通過增強P-選擇素的表達調(diào)節(jié)血管壁的炎癥反應(yīng)參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。

有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ通過氧化應(yīng)激和激活凋亡信號能明顯減少內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量、阻礙受損細胞集落形成和影響細胞遷移，與本實驗結(jié)果特點相符，表明AngⅡ能直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞衰老及P-選擇素的表達并呈劑量依賴性，但其作用機制仍需進一步研究證實。

［1］Kunieda T，Minamino T，Nishi J，et al.AngiotensinⅡ induces premature senescence of vascular smooth muscle cells and accelerates the development of atherosclerosis via a p21-dependent pathway［J］.Circulation，2006，114(9):953-960.

［2］Blake GJ，Ridker PM.Novel clinical markers of vascular wall inflammation ［J］.Circ Res，2001，89(9):763-771.

［3］單海燕，白小涓，劉強，等.血管緊張素II誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞衰老的形態(tài)學研究［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15(3):161-164.

［4］Dimri GP，Lee X，Basile G，et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(20):9363-9367.

［5］Minamino T，Komuro I.Vascular cell senescence contribution to atherosclerosis［J］.Circ Res，2007，100(1):15-26.

［6］Kisucka J，Chauhan AK，Zhao BQ，et al.Elevated levels of soluble P-selectin in mice alter blood-brain barrier function，exacerbate stroke，and promote atherosclerosis［J］.Blood，2009，113(23):6016-6022.