白附片對(duì)健康及腎陽(yáng)虛模型大鼠心電圖及心肌組織病理形態(tài)的影響*

譚 勇，李 健，呂 誠(chéng)，肖 誠(chéng)，許少華，楊 靜，趙宏艷，鞠大宏，呂愛(ài)平△

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體形態(tài)系，北京 100029；3.衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院科研處，北京 100029；

4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700）

既往的研究表明，氫化可的松腎陽(yáng)虛證模型能夠較好地模擬臨床腎陽(yáng)虛證狀態(tài)［1］；白附片可導(dǎo)致健康大鼠和腎陽(yáng)虛模型大鼠血清和心臟組織中酶學(xué)的異常改變，隨著白附片使用的增加，異常程度加重，且與健康大鼠相比，腎陽(yáng)虛模型大鼠酶學(xué)異常改變程度較輕［2-3］。為進(jìn)一步探索白附片醇提物對(duì)健康大鼠和腎陽(yáng)虛模型大鼠的心臟毒性差異，本研究通過(guò)心電圖和心臟組織病理觀察白附片的心臟毒性，從而為基于中醫(yī)對(duì)證動(dòng)物模型評(píng)價(jià)中藥毒性的合理性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量180g～200g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供（合格證號(hào) SCXK-（軍）2007-004）。

1.1.2 藥物 造模用藥注射用氫化可的松琥珀酸鈉（天津生物化學(xué)制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20080604），用生理鹽水配成濃度為 71.43mg/ml的溶液；灌胃給藥：白附片（北京燕京飲片廠，生產(chǎn)批號(hào)081117，產(chǎn)地四川）用乙醇提取制成 2g生藥/ml的溶液（由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所方證研究中心提?。?。

1.1.3 儀器 MP-100型生理實(shí)驗(yàn)信號(hào)采集分析系統(tǒng)（美國(guó) BloAP公司），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和分組 80只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后隨機(jī)分為2組（健康組和模型組）各40只。模型組和健康組中的每只動(dòng)物每天上午在臀部肌肉豐厚處各自注射0.5ml/kg的氫化可的松琥珀酸鈉溶液和生理鹽水溶液，連續(xù) 9d。然后，再把2組動(dòng)物分別隨機(jī)分為低劑量、小劑量、中劑量和大劑量4個(gè)給藥組和空白對(duì)照組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 分組當(dāng)天對(duì)給藥組和空白對(duì)照組大鼠分別灌胃給予10ml/kg的白附片溶液和生理鹽水，每天1次，連續(xù)14d。給藥組給藥濃度從低到高依次為：0.32g/kg、0.64g/kg、1.28 g/kg 和 2.56 g/kg。

1.2.3 取材 給藥結(jié)束后，所有大鼠稱重并于麻醉狀態(tài)下采用頸椎脫臼法處死，迅速取出完整心臟稱取濕重，然后切取部分心臟組織浸入4％的甲醛溶液固定。

1.2.4 心電圖檢測(cè) 在大鼠給藥的第12天以腹腔注射3％戊巴比妥鈉0.10 ml/100g質(zhì)量麻醉大鼠后，使其平躺俯臥于平板上，以 Biopac MP多道生理記錄儀描記Ⅱ?qū)?lián)心電圖，記錄心率（BPM）和峰-峰值（P-P）以及心律失常情況。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察 固定后的心臟組織行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及 HE染色，光鏡觀察并攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

劑量資料，組內(nèi)各劑量處理組間比較采用單因素方差分析，組間采用廣義線性模型兩因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)精確概率法和Logistic回歸分析，顯著性水平取 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 造模及白附片給藥對(duì)大鼠行為形態(tài)的影響

造模致使大鼠精神萎靡、瞇眼、嗜睡，蜷縮、扎堆，對(duì)聲音、觸動(dòng)刺激反應(yīng)遲鈍，以及出現(xiàn)毛聳而臟、失去光澤的表現(xiàn)。給藥致使大鼠不安走動(dòng)，易激惹，雙目、口唇紅赤，飲食減少，呼吸急促，模型大鼠的反應(yīng)較輕。

2.2 白附片對(duì) BPM和 P-P的影響

表1顯示，健康組和腎陽(yáng)虛證組各組內(nèi)比較，2組 BPM在給藥劑量為0.64 g/kg時(shí)，與各自空白組比較，BPM增大，有顯著性差異（P＜0.05），并隨著劑量的加大，BPM增大的趨勢(shì)更明顯，有非常顯著性差異（P＜0.01）；2組 P-P在給藥劑量為 0.32 g/kg時(shí)，與各自空白組比較，P-P增大，有顯著性差異（P＜0.05），亦隨著劑量的加大，P-P增大的趨勢(shì)更明顯，也有非常顯著性差異（P＜0.01）。健康組與腎陽(yáng)虛證組組間比較，BPM和 P-P隨著劑量變化在2組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與腎陽(yáng)虛組 BPM比較，健康組BPM隨著劑量增加而增大的幅度更大。

表1 不同劑量白附片對(duì)健康和腎陽(yáng)虛大鼠BPM和P-P的影響比較±sd）

表1 不同劑量白附片對(duì)健康和腎陽(yáng)虛大鼠BPM和P-P的影響比較±sd）

注：各組內(nèi)比較，與健康空白組比較：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與腎陽(yáng)虛證空白組比較：▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

檢測(cè)指標(biāo) 組 別白附片劑量（g/kg）統(tǒng)計(jì)結(jié)果0 0.32 0.64 1.28 2.56 檢驗(yàn)參數(shù)F P BPM（B） 健康組 379.50 ±36.71 406.00 ±38.24 423.63 ±17.70*436.13 ±19.93＊＊453.88 ±20.39＊＊ 模型檢驗(yàn)19.78 0主效應(yīng)：劑量 54.23 0模型組 387.63 ±10.88 403.14 ±20.28 417.57 ±18.72▲ 424.57 ±14.47▲ 433.25 ±13.13▲▲ 主效應(yīng)：組別 0.15 0.698交互效應(yīng) 3.15 0.080 P-P（V） 健康組 0.34 ±0.14 0.49 ±0.09* 0.68 ±0.16* 1.21 ±0.69＊＊ 1.29 ±0.42＊＊ 廣義線性模型19.81 0主效應(yīng)：劑量 58.80 0模型組 0.32±0.14 0.55±0.27▲ 0.99±0.59▲▲ 0.85±0.29▲▲ 1.58±0.65▲▲ 主效應(yīng)：組別 0.02 0.897交互效應(yīng)0.38 0.541

2.3 白附片對(duì)心律的影響

圖2顯示，白附片對(duì)大鼠心律有顯著影響，其影響主要表現(xiàn)為室性早搏、心動(dòng)過(guò)速等（Ⅱ?qū)?lián)記錄時(shí)間間隔4 s）。表2顯示，對(duì)2組各劑量心律失常數(shù)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，不同劑量給藥對(duì)心律影響不同，劑量越大，心率失常發(fā)生率越高；2組間心律失常發(fā)生率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與腎陽(yáng)虛大鼠比較，健康組大鼠心律失常發(fā)生率隨著劑量增加而增大的幅度更大。

2.4 白附片對(duì)心臟組織形態(tài)的影響

圖4顯示，正常心肌著色均勻，肌纖維粗細(xì)大小較一致，肌核清晰可見(jiàn)，肌膜及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)增多，心肌肌漿內(nèi)未見(jiàn)有粉染粗大顆粒、肌漿凝聚或肌漿溶解，間質(zhì)內(nèi)也未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及瘢痕組織形成，間質(zhì)血管走行及形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常。給藥劑量為0.32 g/kg時(shí)，2組心臟組織無(wú)病理形態(tài)學(xué)改變；給藥劑量為0.64 g/kg時(shí)，健康組心肌著色不均，可見(jiàn)心肌血管擴(kuò)張充血，模型組心肌纖維波浪樣走行，偶見(jiàn)有空泡樣變性；給藥劑量為 1.28g/kg時(shí)，健康組心肌著色不均，有處可見(jiàn)心肌纖維波浪樣走行及心肌纖維消失，其內(nèi)伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組心肌間隔增寬、水腫、血管擴(kuò)張充血；給藥劑量為2.56 g/kg時(shí)，健康組心肌著色不均，伴有肌漿溶解、血管擴(kuò)張充血、心肌間隔增寬、水腫，伴有散在的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，有處可見(jiàn)灶狀心肌出血、肌纖維消失，其內(nèi)伴有單核、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組心肌著色不均，血管擴(kuò)張充血，有處可見(jiàn)灶狀心肌出血。

表2 不同劑量白附片引起健康和腎陽(yáng)虛大鼠心率失常情況比較

圖4 大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)改變

3 討論

治療作用與不良反應(yīng)是藥物本身所固有的兩重性作用，強(qiáng)烈的不良反應(yīng)表現(xiàn)為藥物的毒性。產(chǎn)生毒性的原因是藥物選擇性作用差、作用所涉及的范圍廣泛。當(dāng)其某一效應(yīng)被用作治療目的時(shí)，其他效應(yīng)就有可能成為毒性作用。機(jī)體的生理病理狀況、性別、年齡、遺傳因素、用藥劑量、用藥時(shí)間、藥物相互作用、環(huán)境因素以及機(jī)體的自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定情況均可影響藥物毒性反應(yīng)的發(fā)生［4］。因此，臨床治療疾病必須充分考慮用藥的安全性和有效性，根據(jù)治療需要權(quán)衡利弊，決定取舍，才能有效地避免藥物的毒性反應(yīng)。

中醫(yī)有“有故無(wú)殞”的臨床用藥理論。這個(gè)理論闡述的實(shí)質(zhì)是：只要針對(duì)適應(yīng)證，藥物的不良反應(yīng)甚或毒性反應(yīng)會(huì)降低。“針對(duì)適應(yīng)證”，對(duì)中醫(yī)而言就是對(duì)證，藥證相應(yīng)是避免中藥毒性反應(yīng)的必要條件。而目前多采用健康動(dòng)物評(píng)價(jià)中藥的毒性，這與中醫(yī)臨床實(shí)踐不相符。因此，所得的評(píng)價(jià)結(jié)果不足以充分、合理地說(shuō)明中藥的毒性。鑒于此，我們提出“在對(duì)證狀態(tài)下評(píng)價(jià)中藥毒性”的假說(shuō)。藥物的毒性評(píng)價(jià)主要包括臨床前和臨床中兩方面的評(píng)價(jià)，其中臨床前評(píng)價(jià)是前提和基礎(chǔ)。臨床前評(píng)價(jià)是主要基于各種動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索藥物的毒性以及毒性機(jī)理的過(guò)程。因此，我們首先通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)印證假說(shuō)。

白附片為毛茛科多年生草本植物烏頭的子根加工品。其性剛烈迅捷，走而不守，通上達(dá)下，行表徹里，有上助心陽(yáng)、中溫脾陽(yáng)、下補(bǔ)腎陽(yáng)之殊功，被譽(yù)為“回陽(yáng)救逆第一品藥”。雖然白附片有獨(dú)特、迅捷的療效，但強(qiáng)烈的毒性反應(yīng)限制它在臨床上的廣泛應(yīng)用。現(xiàn)代研究表明，白附片中的雙酯二萜生物堿具有心臟毒性，心律失常是最典型的表現(xiàn)，以頻發(fā)室早最常見(jiàn)，且為多源性，并易形成二聯(lián)律及陣發(fā)性室速、扭轉(zhuǎn)型室速，甚至發(fā)展為室顫［5］。毒性病理學(xué)評(píng)價(jià)是藥物臨床前毒性評(píng)價(jià)中最基本的環(huán)節(jié)，觀察病理形態(tài)學(xué)改變是評(píng)價(jià)毒性的金指標(biāo)［6］。既往有研究表明，白附片可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，使心肌細(xì)胞肌原纖維溶解、斷裂，線粒體增生，肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，閏盤扭曲，膜斷裂［7、8］。鑒于白附片具有明確療效和典型毒性反應(yīng)以及現(xiàn)代研究基礎(chǔ)，我們選擇白附片作為研究對(duì)象，重點(diǎn)研究心臟毒性，把觀察心律失常情況和心臟組織病理形態(tài)學(xué)改變作為觀測(cè)的重點(diǎn)，探索其對(duì)健康和腎陽(yáng)虛對(duì)證模型大鼠心臟毒性差異，以印證假說(shuō)。

本研究結(jié)果表明，白附片導(dǎo)致健康和模型大鼠BPM和P-P增大以及心律失常，這與白附片使迷走神經(jīng)興奮、心肌細(xì)胞鈉鈣通道障礙、心臟電位紊亂等有關(guān)［9-11］。隨著白附片劑量的增加，健康和模型大鼠BPM、P-P和心律失常的程度加重，顯示出顯著的劑量依賴性。雖然2組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是與模型大鼠比較，卻表現(xiàn)出健康大鼠心電圖異常程度更重的趨勢(shì)。若下一步研究加大樣本量，可能出現(xiàn)2組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。心臟組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，白附片致使健康和模型大鼠心臟病理?yè)p傷也存在劑量依賴性，病損程度隨著劑量的增加而加重，且同一給藥劑量時(shí)，2種大鼠心臟病理改變存在明顯的差異，模型大鼠病理改變相對(duì)較輕。總之，以上結(jié)果為“白附片對(duì)腎陽(yáng)虛證大鼠的心臟毒性低于健康大鼠的心臟毒性”假設(shè)提供了一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)合我們以往的研究結(jié)果可以推論，針對(duì)對(duì)證動(dòng)物模型，有毒中藥的毒性反應(yīng)相對(duì)較小。這不僅證明證候作為一種機(jī)體狀態(tài)，是影響藥物是否產(chǎn)生毒性的重要因素，而且說(shuō)明在對(duì)證狀態(tài)下才能全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)中藥的毒性。既往的研究發(fā)現(xiàn)了“基于中醫(yī)證候理論評(píng)價(jià)中藥毒性”的合理性，但這僅僅說(shuō)明了一種客觀存在的現(xiàn)象，其科學(xué)基礎(chǔ)何在，有待進(jìn)一步深入探討。中藥具有多成分、多方向和作用多靶點(diǎn)的特點(diǎn)［12］，證候呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)、多維的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系［13］，因此在對(duì)證狀態(tài)下評(píng)價(jià)中藥的毒性機(jī)制，必然要采用系統(tǒng)、網(wǎng)絡(luò)化的方法?，F(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展為中藥毒性的深入研究提供了新技術(shù)和新方法，采用組學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)、數(shù)據(jù)挖掘等新興的交叉學(xué)科技術(shù)，發(fā)掘、優(yōu)化和完善評(píng)價(jià)方法，全方位探索中藥的毒性及其內(nèi)在機(jī)制，不僅將推動(dòng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化，也將為現(xiàn)代藥物研究提供新思路。

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