實時定量PCR 2-ΔΔCt法檢測非小細(xì)胞肺癌HER2基因的過表達(dá)

奉水東 譚紅專 凌宏艷 袁秀琴

HER2基因過表達(dá)能增強腫瘤的生長、惡性型變及侵襲力，且與較差的臨床預(yù)后和化學(xué)藥物耐受有關(guān)[1]，因此，正確評價HER2基因表達(dá)的狀況對于腫瘤的治療、干預(yù)、預(yù)后估計及抗腫瘤藥物的篩選等具有重要的指導(dǎo)意義。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）HER2基因突變的發(fā)生率很低，但HER2基因的過表達(dá)卻較常見，因此常通過檢測HER2基因的過表達(dá)來探討HER2基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。目前各研究報道的HER2基因過表達(dá)率不一致，這主要與檢測方法的選擇以及方法的敏感性有關(guān)。HER2基因表達(dá)的狀況大多采用免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry, IHC）來進行評價[4-6]，但該方法的變異性較大，操作過程中容易受各種主、客觀因素的影響，如判斷標(biāo)準(zhǔn)、抗體的敏感性以及不同的實驗條件等都可能產(chǎn)生不同的陽性率。因此，采用更為客觀的方法評價HER2基因在肺癌中的表達(dá)很有必要。

近年來出現(xiàn)的實時定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-Q-PCR）技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為了分子生物學(xué)研究的一個重要工具。因此本研究嘗試采用RT-Q-PCR評價NSCLC HER2基因的表達(dá)水平，以期為肺癌臨床干預(yù)策略的制定提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象的來源 選擇2006年6月-2007年6月在湖南省腫瘤醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院和中南大學(xué)湘雅二院三所大型醫(yī)院收治住院并通過病理組織學(xué)確診為NSCLC的所有患者作為研究對象，收集其肺癌組織和與其匹配的非腫瘤組織標(biāo)本各212例，于-80oC冷凍保存。其中包括男性172例，女性40例。病理組織學(xué)類型為：腺癌46例，鱗癌126例，腺鱗癌37例，肺泡細(xì)胞癌3例。TNM分期：I期66例，II期50例，III期70例，IV期26例。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要儀器 包括：SDS-PAGE微型電泳儀及電泳槽（BioRad公司），普通梯度PCR儀（BioRad公司），低溫高速離心機（Eppendorf公司），紫外分光光度計（Beckman公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（Alpha公司），瓷研缽（民生堂大藥房），icycler iQ熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.2.2 主要試劑 包括：Trizol（上海invitrogen公司），焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma公司），AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），瓊脂糖（美國BBI公司），HER2、β-actin引物和探針（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；熱啟動熒光PCR核心試劑盒（上海軒昊科技公司）；dNTPs、TaqDNA聚合酶、100 bp DNA Marker均購自北京天根生化科技有限公司；氯仿、乙醇、異丙醇（均為分析純）購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。引物序列如下：HER2（120 bp）：F: 5'-TCCTGTGTGGACCTGGATGAC-3'；R: 5'-CCAAAGACCACCCCCAAGA-3'；β-actin（207 bp）F: 5’-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3'；R: 5'-AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT-3'。TaqMan探針序列如下：HER2：5'(FAM)-AGCAGAATGCCAACCACCGCAGA-(TAMRA)-3'，β-actin：5'(FAM)-CCTGTGGCATCCACGAAACTACCヰC-(TAMRA)-3'。

1.2.3 實驗方法 HER2基因和內(nèi)標(biāo)基因β-actin在不同的反應(yīng)管中分別擴增，均為20 μL PCR反應(yīng)體系：熱啟動熒光PCR核心試劑10 μL、上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、TaqMan探針（10 μmol/L）3 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水 4 μL。實時定量PCR擴增參數(shù)：預(yù)變性94oC、10 min；94oC變性30 s，60oC延伸1 min，延伸結(jié)束時檢測熒光信號，共40個循環(huán)。

為了驗證方法的特異性，將HER2與β-actin基因的PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳。同時將β-actin和HER2基因的引物互換而探針不變進行RT-Q-PCR檢測，觀察有無熒光信號響應(yīng)。為了觀察RT-Q-PCR的擴增效率，取1份cDNA標(biāo)本分別進行10倍倍比稀釋作為HER2與β-actin基因擴增的模板，每個基因各5管（5個濃度），進行RT-Q-PCR并描繪cDNA對數(shù)濃度與Ct值的相關(guān)曲線，觀察曲線的斜率和相關(guān)系數(shù)，通過斜率計算擴增效率，公式為E=10-1/k-1（E為擴增效率，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）。

1.3 統(tǒng)計分析方法

1.3.1 實驗數(shù)據(jù)處理 為了便于對所檢測樣本進行比較，在RT-Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的閾值，一般這個閾值是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。如果檢測到熒光信號超過閾值被認(rèn)為是真正的信號，它可用來定義樣本的閾值循環(huán)數(shù)（threshold cycles, Ct）。每個模板的Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性反比關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。每個標(biāo)本重復(fù)3次，Ct值取平均值，ΔCt值=HER2基因Ct值-β-actin基因Ct值，以β-actin為對照；ΔΔCt值=肺癌組織HER2的ΔCt值-癌旁組織HER2的ΔCt值，以癌旁組織為對照。以癌旁組織的HER2基因表達(dá)量為1，2-ΔΔCt值即為肺癌組織相對癌旁組織HER2基因表達(dá)的倍數(shù)，測定值以2-ΔΔCt≥2作為高表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.3.2 統(tǒng)計分析方法 所有實驗數(shù)據(jù)使用EpiData 3.0軟件建立數(shù)據(jù)庫。運用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，肺癌組織與癌旁組織中HER2基因表達(dá)水平的差異分析采用Wilcoxon符號秩和檢驗， P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的純度和完整性分析 所提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見兩條清晰的28S和18S RNA條帶，5S隱約可見（圖1），且加樣孔未見亮帶。表明提取的RNA質(zhì)量完好且無DNA污染。取2 μL提取的RNA稀釋500倍，用紫外分光光度計檢測其OD值，A260/A280=1.8-2.0，表明RNA純度較高，符合分析的要求。

2.2 RT-Q-PCR擴增產(chǎn)物鑒定 RT-Q-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可觀察到預(yù)期大小與目的片段一致的電泳條帶（圖2）。

圖 1 RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 The electrophoretogram of RNA in 1% concentration of agarose gel

圖 2 實時定量PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。M：分子量標(biāo)志；1，2：HER2基因擴增片斷；3：β-actin基因擴增片斷。Fig 2 The electrophoretogram of real-time quantitative PCR products in agarose gel. M: DNA marker； 1,2: Fragments of HER2 gene amplification； 3: Fragments of β-actin gene amplification.

2.3 RT-Q-PCR檢測HER2基因mRNA的動力曲線 將cDNA模板各加入不同的反應(yīng)管中，為了檢驗該方法的重復(fù)性，每個基因同一濃度的cDNA設(shè)3個復(fù)孔。在icycler iQ熒光定量PCR儀上進行擴增，結(jié)果顯示同一基因的擴增動力曲線基本重疊（圖3）。從圖中可看出HER2和β-actin擴增的動力曲線都呈S型曲線的形態(tài)。

2.4 RT-Q-PCR特異性測試和擴增效率檢測 HER2與β-actin基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果僅顯示一條與目的片段大小相符合的條帶（圖2）。將β-actin和HER2基因的引物互換，探針不變，同時進行實時熒光檢測，結(jié)果顯示，在45個循環(huán)內(nèi)未檢出陽性信號，說明探針的特異性良好。

分別把10倍倍比稀釋的cDNA模板進行HER2和β-actin基因的實時定量PCR擴增，各5個濃度，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。計算出每個濃度HER2和β-actin基因的平均Ct值以及ΔCt值，通過ΔCt值對cDNA的對數(shù)濃度值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于0，說明目的基因和內(nèi)標(biāo)基因的擴增效率相同，就可以通過RT-Q-PCR 2-ΔΔCt方法進行相對定量。在圖4A中，直線斜率是-0.044,5，接近0，說明可以用RT-Q-PCR 2-ΔΔCt相對法進行分析數(shù)據(jù)。如果所有的PCR反應(yīng)有基本一致的擴增效率，就可以用比較Ct法的相對定量策略，而無需每次PCR時做相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以HER2和β-actin基因的Ct值對相應(yīng)的cDNA對數(shù)濃度作圖（圖4B），HER2和β-actin基因?qū)?yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為0.999,9和0.997,6，斜率分別為-3.424,9和-3.405,2，擴增效率分別為96%和97%。

2.5 HER2基因在肺癌組織與癌旁組織表達(dá)的差異及在肺癌組織中的過表達(dá)率 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，212例肺癌組織和其相應(yīng)的癌旁組織HER2基因均有表達(dá)，肺癌組織HER2基因的中位數(shù)表達(dá)水平為4.67（0.21-48.74），癌旁組織HER2基因的中位數(shù)表達(dá)水平為3.17（0.28-21.26），肺癌組織高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在212例NSCLC中，有72例肺腫瘤組織的HER2基因表達(dá)水平高于癌旁肺組織2倍或2倍以上，過表達(dá)率為34.0%（72/212）。

3 討論

HER2是EGFR家族中表達(dá)相當(dāng)廣泛的受體，在許多上皮源性的腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)[8,9]。以往肺癌HER2基因表達(dá)的研究主要基于免疫組化，使用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和RT-Q-PCR的較少。FISH相對于其它方法有更高的準(zhǔn)確性[10]，但步驟比較繁瑣和復(fù)雜。而RT-Q-PCR相對于前兩者有其獨特的優(yōu)勢，因為RT-Q-PCR可以基于匹配的非腫瘤組織的背景表達(dá)水平對每一個樣本目的基因的表達(dá)水平進行比較精確的測量，有高通量處理樣本的能力和較寬的動力學(xué)范圍，能夠有效地避免交叉污染和實現(xiàn)操作自動化。事實上，在評價乳腺癌HER2基因表達(dá)的狀況時，RT-Q-PCR已經(jīng)被提出作為FISH和IHC的替代方法[11]。

RT-Q-PCR分析可以分為相對定量和絕對定量兩類。相對定量法更加簡單、經(jīng)濟，而且也更為準(zhǔn)確和可靠，因為存在于反應(yīng)體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑不同批次等因素的影響都可以通過加入管家基因作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進行校正而去除。采用實時PCR 2-ΔΔCt相對定量法比較目的基因在不同樣本中的表達(dá)差異必須滿足一定的條件，本研究結(jié)果顯示，在ΔCt與cDNA對數(shù)濃度關(guān)系曲線中，斜率為-0.044,5，接近0，說明目的基因和管家基因的擴增效率基本一致；Ct值對相應(yīng)的cDNA對數(shù)濃度作圖，HER2和β-actin對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為0.999,9和0.997,6，斜率分別為-3.424,9和-3.405,2，擴增效率分別為96%和97%，表明有良好的線性關(guān)系和接近100%的擴增效率。因此，本研究所采用的RT-Q-PCR 2-ΔΔCt相對定量法滿足了其運用的基本條件，表明該方法的應(yīng)用是可行的，無需每次測定制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，只需比較不同組織目的基因與內(nèi)標(biāo)基因的ΔCt值，即ΔΔCt值即可。

圖 3 HER2和β-actin基因?qū)崟r定量PCR擴增動力曲線圖Fig 3 The dynamical curve of real-time quantitative PCR for HER2 and β-actin genes

圖 4 HER2和β-actin基因的實時定量PCR擴增效率檢測。A：HER2和β-actin基因的△Ct與cDNA對數(shù)濃度的關(guān)系曲線；B：HER2和β-actin基因的Ct與cDNA對數(shù)濃度的關(guān)系曲線。Fig 4 The amplification efficiency detection of real-time quantitative PCR for HER2 and β-actin genes. A: the curve of the relation between ΔCt and cDNA logarithmic concentration for HER2 and β-actin genes. B: the curves of the relation between Ct and cDNA logarithmic concentration for HER2 and β-actin genes.

本實驗結(jié)果顯示，肺癌組織相對于癌旁組織HER2基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01）。在212例NSCLC標(biāo)本中， 72例為過表達(dá)（2-ΔΔCt≥2），過表達(dá)率為34.0%（72/212），與Brabender等[12]和Pellegrini等[4]的報道基本一致，提示RT-Q-PCR 2-ΔΔCt法用于檢測NSCLC HER2基因的表達(dá)是可行的。