消瘀散及水提物與醇提物體外透皮特性的比較研究

肖立新 ，彭力平 *，陳光宇 ，何 群 ，王 適

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

消瘀散由大黃、牡丹皮、白芷、姜黃、蒲黃、薄荷、梔子等10味中藥組成，其功能主治為活血化瘀，消腫止痛，系我院用于治療急性軟組織損傷（血瘀證）的外用中藥協(xié)定處方，臨床應(yīng)用已取得了滿意的療效[1]。但散劑劑型較陳舊而且調(diào)制麻煩，臨床使用中起效慢、容易脫落、易過敏、易污染衣物、藥物浪費(fèi)大等諸多缺點(diǎn)日益突出，因此我們急需對其進(jìn)行劑型改革。因劑型不同，對藥材前處理的要求不同，總體分水提與醇提兩類，本試驗(yàn)在提取工藝初篩的基礎(chǔ)上，以藥粉（散劑）作對照，以大黃素[2]為檢測指標(biāo)，對水提物與醇提物用改良的Franz擴(kuò)散池及離體兔皮進(jìn)行體外透皮實(shí)驗(yàn)，比較透皮速度、透皮百分率與皮膚儲量的差別，以探索兩種提取工藝經(jīng)皮滲透性能的差別，為劑型選擇的可行性、合理性提供依據(jù)，為進(jìn)一步的藥效、毒理及臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

Agilent-1200LC高效液相色譜系統(tǒng) (美國安捷倫公司，包括G1311A四元梯度泵,G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站)；島津UV 2450型紫外可見分光光度計；KUDOS SK3300H型浴式超聲儀 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；MA110型電子分析天平 （上海第二天平儀器廠）；Franz擴(kuò)散池（S=3.036 cm2V=23.5 mL）；ZTY 智能透皮實(shí)驗(yàn)儀PP2A（鞏義市英峪予華儀器有限公司）；島津電子分析天平（日本）AUY-120。大黃素（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號110756-200110）；消瘀散 （湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑中心提供）；消瘀散水提物與醇提物（自制）；甲醇為色譜醇；其它試劑均為分析醇；雙蒸水（自制）。動物：新西蘭大白兔由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK(湘)2009-0012。

2 方法與結(jié)果

2.1 消瘀散、水提物、醇提物供試品的制備方法

2.1.1 消瘀散 處方中藥材粉碎，過120目篩，混勻，備用。

2.1.2 消瘀散水提物 處方中藥材適當(dāng)碎斷，姜黃、薄荷等含揮發(fā)油的藥材提取揮發(fā)油，用研磨法制成β-環(huán)糊精包合物；殘?jiān)c剩余藥材水煎煮2次，合并煎液，減壓濃縮成稠浸膏，真空干燥得干浸膏，按等量遞增法加入揮發(fā)油包合物，混勻，備用。

2.1.3 消瘀散醇提物 處方中藥材粉碎，過10目篩，加乙醇回流2次，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至無醇味，再于水浴上濃縮成稠浸膏，真空干燥得干浸膏，備用。

2.2 大黃素的HPLC定量方法

2.2.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～25 min（75∶25）；25～35 min(75∶25→85∶15)；35～40 min(85∶15→75∶25)；40～50 min(75∶25)；流速1.0 mL/min；檢測波長 254 nm；進(jìn)樣量 10 μL；柱溫為30℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取大黃素對照品16.5 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 mL，取1.0 mL用甲醇定容至10 mL，再取1.0 mL用甲醇定容至10 mL作為對照品溶液，大黃素質(zhì)量濃度為16.50 μg/mL。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取消瘀散及水提物與醇提物 (3種供試品生藥濃度一致)約3.0、2.3、1.6 g左右，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25.0 mL，超聲30 min，放冷，再精密稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5.0 mL，揮去溶劑，殘?jiān)?%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，超聲30 min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷(約5 mL)洗滌容器，并入分液漏斗中，振搖萃取，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照液的制備 取不含大黃的其余9味藥材按相應(yīng)的提取方法制備成散劑，再按“2.2.3”法將提取物樣品處理成分析用樣品 （即陰性供試品溶液）。

2.2.5 分離條件的考察 按“2.2.1”色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各10μL，注入高效液相色譜儀內(nèi)，調(diào)整出峰時間及峰形，使達(dá)到符合要求的分離效果，同條件下陰性無干擾。見圖 1～5。

2.2.6 樣品中大黃素含量測定 分別精密吸取對照品與3種供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，用外標(biāo)一點(diǎn)法計算大黃素含量。

圖1 大黃素對照品HPLC圖

圖2 消瘀散水提物樣品HPLC圖

圖3 消瘀散醇提物樣品HPLC圖

圖4 消瘀散散劑樣品HPLC圖

圖5 大黃陰性樣品HPLC圖

2.2 離體兔皮的制備和處理

取體質(zhì)健康的新西蘭大白兔1只，耳緣靜脈注射空氣后致死，剝離兔皮，小心除去皮下脂肪和組織，用新鮮配置的生理鹽水反復(fù)沖洗，用剪刀除去腹部的兔毛（切勿損傷皮膚），以8%的硫化鈉溶液涂布在離體皮膚上，5 min后用棉簽去除褪下的兔毛，然后用生理鹽水沖洗干凈，最后浸泡于生理鹽水中，-26℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)用完。每次實(shí)驗(yàn)前1 h取出，同時檢查兔皮的完整性，不能有任何破損。

2.3 實(shí)驗(yàn)裝置及步驟

采用改良的單室Franz擴(kuò)散池，將生理鹽水加入到接收池中，真皮層一側(cè)面向Franz擴(kuò)散池的接收池，螺絲加固，確保無氣泡產(chǎn)生，使其與離體兔皮緊密接觸，緊貼于離體兔皮上，并觀察接收池中接觸兔皮面有無氣泡，若有氣泡，從取樣口排除氣泡，并補(bǔ)充生理鹽水至刻度。將固定好裝置的Franz擴(kuò)散池放入ZTY智能透皮實(shí)驗(yàn)儀PP2A中，水浴溫度37℃，電磁恒速攪拌（60 r/min），分別取各實(shí)驗(yàn)樣品2 g，精密稱定，裝入供給池中，使之緊貼表皮層無氣泡，計時，分別在透皮時間為 4、6、8、10、12、24、30、36、48、60、72 h 時，從接收池中取出 12 mL 接收液，同時補(bǔ)充等量的生理鹽水，同樣保持接收液面與皮膚之間無氣泡產(chǎn)生。

2.4 透皮樣品的處理

精密吸取每個時間點(diǎn)取出的透皮接收液，分別置于100 mL的錐形瓶中，蒸干，加8%鹽酸溶液5 mL，超聲處理2 min，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，高效液相進(jìn)樣10μL測定。分別計算消瘀散及水提物與醇提物中大黃素的累計透過百分率。

2.5 皮膚儲量的測定

將最后一次取樣后的皮膚取下，用剪刀剪去擴(kuò)散池口上對應(yīng)的皮膚以外的皮膚部分，將擴(kuò)散池口大小的皮膚用眼科小剪刀盡快剪碎成皮膚碎塊，用移液管先取總量2/3的生理鹽水于燒杯內(nèi)，將盛有皮膚碎塊的小燒杯放入冰水中，將剪碎的皮膚倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3冷的生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎皮膚塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)10次（6～8 min），充分研碎，使皮膚碎塊勻漿化。然后加8%鹽酸溶液10 mL， 超聲處理10 min， 離心 （4 000 r/min，15 min）取上層清液，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10μL，進(jìn)高效液相色譜儀測定大黃素含量。

2.6 消瘀散及水提物與醇提物累計透皮百分率的測定結(jié)果見表1、圖6。

表1 消瘀散及水提物與醇提物的累積透皮百分率 （%）

圖6 消瘀散及水提物與醇提物體外經(jīng)皮滲透動力學(xué)曲線圖

2.7 散劑及水提物與醇提物中大黃素透皮動力學(xué)數(shù)學(xué)模型的擬合

對表1中消瘀散及水提物與醇提物的體外透皮試驗(yàn)結(jié)果采用幾種接近的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，建立透皮動力學(xué)方程（數(shù)學(xué)模型），見表2。

由數(shù)學(xué)模型擬合結(jié)果可知，消瘀散及水提物與醇提物中大黃素累積透皮百分率與時間t的函數(shù)關(guān)系，散劑最接近JohnsonSchumacher模型，水提物最接近一元線性回歸模型，醇提物最接近邏緝斯蒂模型，將找出的最優(yōu)數(shù)學(xué)模型（數(shù)學(xué)方程）列于表3。

表2 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素透皮動力學(xué)數(shù)學(xué)模型的擬合

表3 消瘀散及水提物與醇提物中對應(yīng)的大黃素透皮動力學(xué)最優(yōu)數(shù)學(xué)方程

2.8 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素體外透皮動力學(xué)參數(shù)的提取及比較

由表4中的計算結(jié)果可知，透皮速度快的T8%值小，透皮總量多者Q72h大，消瘀散及水提物與醇提物的透皮速度參數(shù)T8%值、透皮總量參數(shù)Q72h值可信區(qū)間未重疊，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，故透皮速度由快至慢依次為：醇提物＞水提物＞散劑；透皮總量由多至少依次為：醇提物＞水提物＞散劑；水提物的體外透皮速率是散劑的2.529倍，水提物透皮總量是散劑的2.806倍；醇提物的體外透皮速率是水提物的2.178倍，是散劑的5.509倍，醇提物的體外透皮總量是水提物的1.932倍,是散劑的5.421倍。

表4 各組中大黃素透皮動力學(xué)參數(shù)的提取及比較（可信區(qū)間重疊法）[4]

2.9 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素皮膚儲存量的測定結(jié)果

由表5可知，各組大黃素皮膚儲量測定結(jié)果95%可信區(qū)間皆未重疊，差別有統(tǒng)計意義，故皮膚儲量由高到低依次為：醇提物＞水提物＞消瘀散，醇提物是水提物的4.21倍，是散劑的16.63倍，水提物是散劑的3.95倍。

表5 消瘀散及水提物與醇提物中大黃素皮膚儲存量的測定結(jié)果 （n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)原設(shè)計擬采用3個評價指標(biāo)綜合評分，但因本方系10味中藥的大復(fù)方，有效成分含量低、干擾大，最終僅大黃素通過梯度洗脫成功分離，可定量檢測。

藥物透皮屬被動擴(kuò)散機(jī)制，與藥物的脂溶性成正比，醇提物脂溶性成分提取量多，故透皮速度比水提物快、透皮總量多；散劑中藥物必須先從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外擴(kuò)散到皮膚表面，然后才能透過皮膚，故透皮速度慢，透皮總量少，藥物大部分未進(jìn)入皮內(nèi)發(fā)揮作用；水提物因無藥渣，故透皮速度、透皮總量介于兩者之間。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，12 h之前，各組透皮速度相差不大，12 h之后，差別顯著，變化最大的是12～48 h這段時間，48 h透皮量趨于飽和，故透皮速度參數(shù)定為消瘀散透皮最大量對應(yīng)的時間即T8%，透皮總量參數(shù)定為72 h對應(yīng)的累積透皮百分率。

外用制劑經(jīng)皮滲透特性主要參數(shù)有透皮速度及某時間的透皮量，這兩個參數(shù)不能直接測出，通過實(shí)驗(yàn)測得的不同時間透皮百分率數(shù)據(jù)，建立兩者的函數(shù)關(guān)系（數(shù)學(xué)方程），函數(shù)關(guān)系（數(shù)學(xué)方程）有多種（γ＞γ臨），通過比較 R2（包括抽樣誤差）、F、P 值，找出最優(yōu)數(shù)學(xué)模型（數(shù)學(xué)方程），R2、F愈大，P值愈小，說明該函數(shù)關(guān)系（數(shù)學(xué)方程或數(shù)學(xué)模型）愈準(zhǔn)確，誤差愈小，進(jìn)而求出的透皮速度及某時間的透皮量愈正確，誤差范圍愈小。

[1]林松青，彭力平.消瘀散治療急性軟組織損傷的臨床療效研究[J].中醫(yī)正骨，2009，4（21）：10-11.

[2]陳德昌,景炳文,楊興易.大黃對燙傷大鼠肝臟內(nèi)細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，1999，10（11）：587-590.

[3]沈陽藥學(xué)院.高等數(shù)學(xué)（下冊）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：389.

[4]何 群，鄧桂明，楊廣民，等.咳喘穴位貼片與貼散體外透皮特性比較研究[J].中國中藥雜志，2007，32（18）：1 877-1 880.