益胃消瘀顆粒對萎縮性胃炎大鼠胃黏膜腸化的影響?

田鋒亮，楊小軍，陳萬群，劉 宇，李延萍

(重慶市中醫(yī)院，重慶 400021)

胃黏膜腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)是指病變部位的胃黏膜上皮被腸型上皮取代的現(xiàn)象，一般由胃固有腺體頸部未分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，光鏡下胃黏膜上皮中出現(xiàn)腸上皮的杯狀細(xì)胞、吸收細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和糖原染色陽性的具有刷狀緣的細(xì)胞。它是一種癌前病變，可增加胃癌發(fā)病的風(fēng)險。胃癌經(jīng)歷了淺表性胃炎-萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生-胃癌的多步驟復(fù)雜的發(fā)展過程[1-2]，對胃黏膜腸化生的治療可能成為胃癌早期干預(yù)的突破點。目前腸化的發(fā)生機制尚不清楚，研究認(rèn)為NK6同源框蛋白3(NK6 Homeobox Protein 3,NKX6.3)為胃黏膜上皮分化的重要調(diào)節(jié)器，可通過對尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(Caudal-related homeobox transcription factor2,CDX2)、干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子性別決定相關(guān)基因簇2(Sex de-termining region Y-box 2,SOX2)、骨形成蛋白4(bone morphogenic protein 4, BMP4)調(diào)控干預(yù)腸化的過程[3]。目前尚無有效的西藥治療萎縮性胃炎及腸化，某些中藥及相關(guān)制劑對萎縮性胃炎腸化的研究報道較多，部分提示能夠逆轉(zhuǎn)萎縮腸化的發(fā)生。既往臨床觀察提示，益胃消瘀顆粒治療萎縮性胃炎及癌前病變有效[4]。本實驗采用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N’-Nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)造模[5-6]的萎縮性胃炎腸化大鼠，給予益胃消瘀顆粒治療后觀察其對大鼠胃黏膜組織的病理形態(tài)及NKX6.3、CDX2、SOX2、BMP4表達(dá)的影響，探討益胃消瘀顆粒對萎縮性胃炎胃黏膜腸化大鼠的治療作用、潛在機制及靶點。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性SD 大鼠 60只，8周齡，體質(zhì)量180 g～200 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK-PLA-20120031。并經(jīng)試驗動物倫理審查委員會審查通過，全程SPF級環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 藥物及配制

益胃消瘀顆粒由紅參、三七、白術(shù)、薏苡仁、法落海、娑羅子、浙貝母等藥物組成，由重慶市中醫(yī)院制劑室制作，1 g顆粒相當(dāng)于原藥劑量的5.5 g。MNNG試劑購于TCL公司。MNNG先用去離子水配成1 g/L的儲備液(每周配制1次)，4 ℃冰箱避光保存，用前以自來水稀釋為50 mg/L濃度的溶液，裝入涂有黑漆的避光飲水瓶內(nèi)供大鼠自由飲用。法莫替丁購于阿拉丁公司，配制成含0.004%法莫替丁的粉末狀飼料。

1.3 主要試劑與儀器

NKX6.3抗體(貨號AF0302，分子量34 kDa)；BMP4(貨號DF6461，分子量47 kDa，Affinity公司)。CFX96定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；WB成像系統(tǒng)(英國SYNGENE公司)；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模與分組 60只雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、益胃消瘀顆粒高、中、低劑量組、胃復(fù)春組各10只，空白組常規(guī)喂養(yǎng)，其余50只采用MNNG聯(lián)合法莫替丁誘導(dǎo)造模。MNNG給予大鼠自由飲用，每24 h更換1次藥液，造模期間不再提供其他飲水，并給予含0.004%法莫替丁飼料喂養(yǎng)。造模6個月抽檢空白組、模型組、益胃消瘀顆粒高劑量組各1只，空白組提示胃黏膜組織正常，模型組、益胃消瘀顆粒高劑量組病理提示僅存在萎縮未見腸化，7個月再次抽檢空白組、益胃消瘀顆粒高、低劑量組各1只，益胃消瘀顆粒高、低劑量組病理改變均提示萎縮伴腸化，存活54只大鼠即為有效動物。

1.4.2 用藥 7個月造模成功后各組均不再給予造模藥物，空白組及模型組大鼠給予正常食水；益胃消瘀顆粒3劑量組大鼠給予正常飲水，益胃消瘀顆粒低劑量組按0.75 g/(kg·d)給予益胃消瘀顆粒飼料喂養(yǎng)給藥，中劑量組按1.5 g/(kg·d)給藥，高劑量組按2.25 g/(kg·d)給藥，每日2次；胃復(fù)春組給予正常飲水，按0.45 g/(kg·d)胃復(fù)春顆粒飼料給藥。因造模時間長，造模后大鼠一般情況差，部分死亡，故給予益胃消瘀顆粒及胃復(fù)春飼料給藥避免長期灌胃加重?fù)p害，給藥過程中每日再稱量無效消耗量進行補充，以保證藥物的用量。給藥過程中，模型組、胃復(fù)春組大鼠各死亡1只，給藥3個月結(jié)束后剩余52只大鼠，處死動物留取標(biāo)本。

1.4.3 胃黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察 胃黏膜標(biāo)本固定于10%的中性福爾馬林溶液中，固定48 h后剪成約2 cm的條狀物，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，觀察病理組織學(xué)改變。

1.4.4 RT-qPCR檢測胃黏膜標(biāo)本中Cdx2、Sox2 mRNA的表達(dá) 引物由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成，提取大鼠胃黏膜組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行實時定量PCR(RT-qPCR)擴增，β-actin引物F -CCCATCTATGAGGGTTACGC，R- TTTAATGTCACGCACGATTTC，Sox2正義鏈：5′-CCATGGGCTCTGTGGTCAAG-3′，反義鏈：5′-CTG- GGCCATGTGCAGTCTAC-3′，產(chǎn)物長度173 bp；Cdx2正義鏈：5′-GCGGCGAAA- CCTTTGTGAAT-3′，反義鏈：5′-GCCAACTCAGCTTTCCTCCT-3′，產(chǎn)物長度177 bp。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min，40個擴增循環(huán)，每循環(huán)95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，熔解曲線: 60～95 ℃。反應(yīng)結(jié)束后，將原始數(shù)據(jù)、擴增曲線和熔解曲線等信息從定量軟件中導(dǎo)出進行分析，得出各個樣本目的基因的Ct值，用相對定量2-△△Ct法分析結(jié)果。

1.4.5 Western blot檢測胃黏膜標(biāo)本中NKX6.3、BMP4蛋白表達(dá) 從胃組織中抽提蛋白質(zhì)，BAC法測定總蛋白濃度。取50 mg總蛋白與上樣液混合，上樣前100 ℃煮沸5 min。將蛋白加入點樣孔，電泳初始電壓80 V，溴酚藍(lán)染料的前緣進入分離膠上緣后提高電壓至100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)染料到達(dá)分離膠底部時停止電泳。恒流30 mA，電轉(zhuǎn)120 min。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出PVDF膜并標(biāo)記膜的方向。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，室溫振蕩60 min。TBST漂洗液洗膜 8 min共3次，將膜移入雜交器皿中，加入用一抗稀釋液按1∶1 000進行稀釋的抗體(NKX6.3和BMP4)，封口后4 ℃孵育過夜；用TBST漂洗液搖蕩洗膜10 min共3次，將PVDF膜移入另一新的雜交器皿中，加入二抗稀釋液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，37 ℃振蕩60 min。加入ECL顯色液進行顯色并拍照，用IPP軟件分析目的條帶灰度值，經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

空白組大鼠毛發(fā)光澤，神態(tài)安逸，活動敏捷，食量較大，形體較大，大便顆粒狀。模型組大鼠毛發(fā)色澤枯、疏松，精神萎靡、懶于活動且遲鈍，食量減少，形體偏消瘦，體質(zhì)量增加緩慢，大便時稀。用藥期間各治療組大鼠經(jīng)治療后，其毛色、精神狀態(tài)、食欲、活動情況等均有不同程度改善，而以益胃消瘀顆粒高、中劑量組一般情況改善最明顯，低劑量組和胃復(fù)春組次之，模型組最差。

2.2 胃黏膜組織結(jié)構(gòu)改變結(jié)果

圖1示，光鏡觀察結(jié)果，空白組黏膜上皮完整，固有層見密集排列的腺體，腺體大小、形態(tài)規(guī)則，散在少量淋巴細(xì)胞，未見胃黏膜萎縮(圖1 A)。模型組黏膜顯示慢性炎癥，黏膜腺體減少，排列紊亂，可見囊性擴張的腺體，腺上皮可見不同程度的腸化，固有層淋巴細(xì)胞灶性浸潤，黏膜肌層增厚(圖1B)。益胃消瘀顆粒高劑量組可見黏膜萎縮程度減輕，腺體增多，排列規(guī)則，散在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(圖1C)。益胃消瘀顆粒中劑量組黏膜萎縮程度減輕，腺體排列規(guī)則，腸化明顯減少，可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞散在浸潤，小血管擴張充血，纖維組織增生(圖1D)。益胃消瘀顆粒低劑量組黏膜仍見萎縮，但較模型組稍減輕，黏膜腺體稍增加，囊性擴張腺體減少，排列稍規(guī)則，腸化減少，可見固有層淋巴細(xì)胞灶性浸潤，小血管擴張充血(圖1E)。胃復(fù)春組黏膜萎縮程度減輕，黏膜腺體增多，排列稍規(guī)則，散在淋巴細(xì)胞浸潤 (圖1F)。

注：A.空白組；B.模型組；C.益胃消瘀顆粒高劑量組；D.益胃消瘀顆粒中劑量組；E.益胃消瘀顆粒低劑量組；F.胃復(fù)春組圖1 光鏡下各組大鼠胃黏膜組織結(jié)構(gòu)改變(HE，×100)

2.3 RT-qPCR檢測各組大鼠胃黏膜組織Cdx2、Sox2 mRNA表達(dá)

表1示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織Cdx2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，益胃消瘀顆粒高、中、低劑量組及胃復(fù)春組大鼠胃黏膜Cdx2mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與空白組比較，模型組Sox2mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，益胃消瘀顆粒高、中、低劑量組及胃復(fù)春組Sox2mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，以益胃消瘀顆粒高劑量組升高最明顯(P<0.05)。

2.4 Western blot檢測各組大鼠胃黏膜組織NKX6.3和BMP4的蛋白表達(dá)

圖2表2示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中NKX6.3表達(dá)明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，益胃消瘀顆粒高劑量組及中劑量組大鼠胃黏膜組織NKX6.3含量明顯升高(P<0.01)，胃復(fù)春組表達(dá)也有明顯上升(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織BMP4含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，益胃消瘀顆低、中及高劑量組BMP4含量均明顯下降(P<0.01)。

3 討論

中醫(yī)典籍中未見“慢性萎縮性胃炎腸化”(CAG)病名，多根據(jù)臨床所見胃脘痞滿、胃中嘈雜、痞或不痛、納差等表現(xiàn)，將其歸屬于“胃痞”“胃脘痛”等范疇。認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實證，以脾陽氣虛、胃陰虛為本，以氣郁、濕熱、痰濁、瘀血為標(biāo)，病位在脾胃，與肝的關(guān)系密切，辨證多采用理氣、化濕、清熱、活血、補虛、通陽等法治療[7-9]。根據(jù)本病特點自擬益胃消瘀顆粒組方，由紅參、三七、白術(shù)、薏苡仁、法落海、娑羅子、浙貝母等藥物組成，具有益氣溫陽、行氣化濕、活血化瘀之效，經(jīng)多年臨床驗證療效確切。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠胃黏膜萎縮及腸化，而益胃消瘀顆粒高、中劑量組大鼠胃黏膜腸化情況均較模型明顯改善，胃復(fù)春組及益胃消瘀顆粒低劑量組大鼠胃黏膜萎縮及腸化有所減輕，提示益胃消瘀顆粒對萎縮性胃炎大鼠胃黏膜萎縮及腸化有明確的治療作用，且效果優(yōu)于胃復(fù)春組。

表1 RT-qPCR檢測各組大鼠胃黏膜組織Cdx2、Sox2mRNA表達(dá)比較

注：1.空白組；2.模型組；3.益胃消瘀顆粒高劑量組；4.益胃消瘀顆粒中劑量組；5.益胃消瘀顆粒低劑量組；6.胃復(fù)春組圖2 Western blot檢測條帶結(jié)果比較

表2 Western blot檢測結(jié)果灰度分析

Cdx2是尾型相關(guān)同源盒基因家族中的一員，以轉(zhuǎn)錄因子的形式調(diào)節(jié)DNA表達(dá)，參與腸細(xì)胞的增殖、分化、黏附、遷移以及癌變。有報道認(rèn)為[10]，Cdx2在正常的胃黏膜上皮細(xì)胞中不表達(dá)，但在發(fā)生腸化生的胃黏膜細(xì)胞中高表達(dá)，過表達(dá)Cdx2對隱窩細(xì)胞的增殖作用明顯增強。王柏樺等[11]研究認(rèn)為，Cdx2蛋白在胃黏膜細(xì)胞中的異位表達(dá)是發(fā)生胃黏膜腸化生的重要起始事件，Cdx2表達(dá)異常與腸化生的發(fā)生和進展與胃癌密切相關(guān)。陳柏君等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過增強Cdx2轉(zhuǎn)錄能使胃黏膜干細(xì)胞向腸上皮細(xì)胞分化，杯狀細(xì)胞形成增多，促進胃黏膜腸上皮化生的形成。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜CDx2表達(dá)明顯升高，與模型組比較益胃消瘀顆粒高、中、低劑量組及胃復(fù)春組CDx2均有下降，提示益胃消瘀顆粒對CDx2的表達(dá)有明顯的抑制作用，其改善萎縮及腸化的作用可能與抑制CDx2表達(dá)有關(guān)。

Sox2是一類Y染色體性別決定區(qū)(SRY) 相關(guān)基因家族成員之一[13]，通過 HMG結(jié)構(gòu)域識別靶基因，在調(diào)控組織的增殖發(fā)育、決定細(xì)胞分化方向和維持干細(xì)胞的全能性、保持不分化狀態(tài)方面具有重要作用[14]。牛海靜等[15]認(rèn)為，Sox2基因特異性表達(dá)于正常胃上皮細(xì)胞中，可調(diào)節(jié)腸上皮特異性基因Cdx2和 Muc2 的表達(dá)，在胃上皮化生為腸上皮過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜Sox2表達(dá)明顯下降；與模型組比較，高劑量組與中低劑量組及胃復(fù)春組Sox2表達(dá)明顯升高，提示益胃消瘀顆粒對Sox2的表達(dá)有明顯促進作用，其改善萎縮及腸化可能與上調(diào)CDx2表達(dá)有關(guān)。

BMP4屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員之一，在腫瘤形成過程中發(fā)揮著重要作用[16]。馬松林等[17]研究認(rèn)為，BMP4 能促進胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲，其機制可能與上調(diào)Snail 表達(dá)有關(guān)，BMP4通過經(jīng)典的信號傳導(dǎo)子SMAD4在胃細(xì)胞系中上調(diào)Cdx2的表達(dá)[18]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜BMP4含量明顯上升，益胃消瘀顆低、中、高劑量組及胃復(fù)春組BMP4下降明顯，提示益胃消瘀顆粒能夠抑制BMP4的表達(dá)，其改善萎縮及腸化可能與抑制CDx2表達(dá)有關(guān)。

NKX6.3是一種同源框轉(zhuǎn)錄因子，研究認(rèn)為NKX6.3為胃黏膜上皮分化的重要調(diào)節(jié)器。NKX6.3在腸化的胃黏膜中表達(dá)顯著減少，NKX6.3表達(dá)水平與Sox2呈正相關(guān)，而與Cdx2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在AGS及MKN細(xì)胞中，NKX6.3通過直接作用于Cdx2及Sox2兩個基因的啟動子部分來調(diào)節(jié)二者的表達(dá)。NKX6.3細(xì)胞核的表達(dá)僅在非腸化的胃上皮中可檢測到，NKX6.3可抑制胃癌分化和腫瘤發(fā)生[19]。本研究結(jié)果提示，與空白組比較，模型組NKX6.3下降明顯，與模型組比較，益胃消瘀顆粒高、中劑量組及胃復(fù)春組升高明顯，提示益胃消瘀顆粒對NKX6.3的表達(dá)有激活促進作用，其改善萎縮及腸化作用可能與干預(yù)NKX6.3有關(guān)。

Cdx2異位表達(dá)及Sox2的下調(diào)可以誘導(dǎo)未分化的胃干細(xì)胞向腸上皮細(xì)胞分化，Sox2可能在胃上皮及細(xì)胞中Cdx2基因甲基化的構(gòu)成及保持方面發(fā)揮重要作用[3]。NKX6.3表達(dá)水平與Sox2呈正相關(guān)，而與Cdx2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，NKX6.3誘導(dǎo)TWSG1連接到BMP4，從而抑制BMP4連接到BMPR-II[20]。結(jié)合本研究的結(jié)果認(rèn)為，益胃消瘀顆?？赡芡ㄟ^激活NKX6.3表達(dá)、下調(diào)CDx2、上調(diào)Sox2，抑制BMP4而達(dá)到改善萎縮及腸化的效果。但本研究尚不能明確NKX6.3與Cdx2、Sox2、BMP4之間的內(nèi)在通路與靶向關(guān)系，需要進一步研究加以確定。