密蒙花總黃酮對(duì)去勢(shì)雄鼠干眼癥淚腺組織中白細(xì)胞介素-1β表達(dá)的影響

陳佳文，彭清華*，姚小磊*，王 方，李懷風(fēng)，吳權(quán)龍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

干眼癥是由于淚液的量或質(zhì)的異常，淚膜不穩(wěn)定和眼表損害而導(dǎo)致的一組眼不適癥狀，又稱角結(jié)膜干燥癥。其多發(fā)生于大于60歲的女性，是常見的眼表疾病[1]。目前干眼癥的病因尚未明確，炎癥可能是各種類型干眼癥發(fā)病的共同機(jī)制，而雄激素水平的異?？赡苁谴搜装Y反應(yīng)發(fā)生的重要原因[2]。前期研究[3]表明密蒙花提取物治療可顯著抑制雄激素水平降低后兔干眼癥的發(fā)生，其作用機(jī)制可能與黃酮類物質(zhì)發(fā)揮擬雄激素效應(yīng),從而調(diào)節(jié)淚腺局部炎癥反應(yīng)有關(guān)。為揭示密蒙花總黃酮治療雄激素水平降低所致干眼癥的治療機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用進(jìn)一步提供科學(xué)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)觀察了其對(duì)去勢(shì)導(dǎo)致干眼癥雄鼠淚腺組織中白細(xì)胞介素-1β表達(dá)的影響?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康、無眼部疾患、1個(gè)月齡Wistar雄性大鼠150只，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，遠(yuǎn)交系，體質(zhì)量100 g左右。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 藥物 密蒙花（產(chǎn)于湖南邵陽）：密蒙花干藥材由湖南九匯現(xiàn)代中藥有限公司提供，其總黃酮制備由課題組在湖南省植物提取工程提取中心完成（密蒙花藥材中蒙花苷含量為0.85%，提取成品中蒙花苷含量約17%，蒙花苷中總黃酮含量＞80%）；丙酸睪酮注射液 （25 g/L，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H12020531）。

1.1.3 試劑 鼠抗人IL-1β單克隆抗體：重慶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；SABC試劑盒：重慶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；DAB顯色劑：重慶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)對(duì)照組、模型組、丙酸睪酮組、密蒙花總黃酮組，每組30只；每組造模后1，3，5月各10只。動(dòng)物模型制作[4]，將實(shí)驗(yàn)鼠切除雙側(cè)睪丸及附睪；假手術(shù)組只切開陰囊而不切除睪丸，正常組不做任何處理。造模后1周，待傷口基本愈合開始用藥。正常組、假手術(shù)對(duì)照組、模型組以生理鹽水灌胃，1次/d；丙酸睪酮組用丙酸睪酮注射液1 mg/kg大腿肌內(nèi)注射，1次/3 d；密蒙花總黃酮組以密蒙花總黃酮20 mg/kg與生理鹽水混懸液灌胃，1次/d。造模后1，3，5個(gè)月后各組10只大鼠，20%烏拉坦腹腔注射全身麻醉下斷頭法處死動(dòng)物，即刻摘除雙眼眶外淚腺，低溫保存，用4%多聚甲醛固定，供免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)使用。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-1β的表達(dá) 標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，采用免疫組織化學(xué)SABC法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。各組標(biāo)本切片后均按試劑盒說明書進(jìn)行染色，陽性對(duì)照采用乳腺癌石蠟切片，陰性對(duì)照采用PBS液代替一抗。結(jié)果判定：陰性對(duì)照染色結(jié)果未見IL-1β特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)物。陽性結(jié)果為組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明確棕黃或棕褐色顆粒。Image-proplus4.5圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每張切片陽性表達(dá)的累計(jì)光密度值。在40×10的高倍視野下，每張切片選擇具有代表性的5個(gè)陽性視野，選取空白區(qū)定標(biāo)，測(cè)定每個(gè)視野的光密度，求其平均值。平均光密度值越小，表示陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)越強(qiáng)烈。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠淚腺IL-1β表達(dá)的病理形態(tài)學(xué)改變

正常淚腺上皮細(xì)胞為高柱狀，核居基底部，淚腺上皮細(xì)胞近腔間有大量分泌泡狀黏液細(xì)胞。腺體中淚滴多而細(xì)胞漿內(nèi)無明顯棕黃色顆粒沉著，即無IL-1β陽性表達(dá)。本研究中病理形態(tài)學(xué)改變以去勢(shì)造模后5個(gè)月才明顯。去勢(shì)造模后5個(gè)月正常組和假手術(shù)對(duì)照組淚腺組織中可見少許棕黃色顆粒沉著，即IL-1β幾乎無陽性表達(dá)；模型組組織切片中有大量棕黃色顆粒沉著，即IL-1β大量陽性表達(dá)；丙酸睪酮組和密蒙花總黃酮組組織切片中可見IL-1β有表達(dá)，即有較多棕黃色顆粒沉著（見圖1）。

圖1 密蒙花總黃酮對(duì)去勢(shì)雄鼠干眼癥淚腺組織IL-1β病理形態(tài)學(xué)影響光鏡圖（免疫組化染色×200）

2.2 各組大鼠淚腺組織中IL-1β表達(dá)比較

淚腺組織中IL-1β的表達(dá)比較：造模后1，3，5月，正常組、假手術(shù)組IL-1β平均光密度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；密蒙花總黃酮組和丙酸睪酮組平均光密度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常組、假手術(shù)對(duì)照組的IL-1β表達(dá)顯著低于丙酸睪酮組、密蒙花總黃酮組（P＜0.05）；密蒙花總黃酮組平均光密度值高于丙酸睪酮組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠淚腺IL-1β陽性反應(yīng)細(xì)胞的平均光密度值 s，n=10）

表1 各組大鼠淚腺IL-1β陽性反應(yīng)細(xì)胞的平均光密度值 s，n=10）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與丙酸睪酮組、密蒙花總黃酮組比較*P＜0.05。

時(shí)間1月3月5

3 討論

近年來研究表明基于免疫的炎癥反應(yīng)是各種類型干眼癥發(fā)病的共同機(jī)制,干眼癥患者淚液和結(jié)膜上皮中的多種細(xì)胞因子包括 IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平較正常人有顯著改變，且與干眼癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[5]，而性激素水平的異?？赡苁菍?dǎo)致此炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要因素[2]。劉超等[6]通過去勢(shì)雄兔實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到雄激素水平降低可能通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控發(fā)生改變，導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子表達(dá)的改變，主要通過加重眼表組織炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡途徑，損傷淚腺結(jié)構(gòu)、降低淚腺分泌功能；并且通過加重角膜炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，加重癥狀，導(dǎo)致干眼癥。而目前對(duì)干眼癥炎癥反應(yīng)研究較多的是IL-1和TGF，因?yàn)镮L-1是最重要的促炎因子[7]。Solomon[8]認(rèn)為IL-1在角結(jié)膜干燥癥（KCS）發(fā)病中起關(guān)鍵作用，因?yàn)楦裳郯Y常常伴隨著IL-1濃度增加。IL-1β可以刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF；通過單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-8介導(dǎo)對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用；刺激中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)；促進(jìn)肝細(xì)胞合成急性時(shí)相蛋白；誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，黏附分子增加，白細(xì)胞與VEC的粘附，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-2、IL-6和PG等，引起炎癥[4]。通過本實(shí)驗(yàn)研究中模型組IL-1β隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且5個(gè)月后模型組與正常組比較差異仍有顯著性，也證實(shí)了去勢(shì)后大鼠缺乏雄激素將導(dǎo)致IL-1β的增加。

密蒙花屬清熱瀉火藥，為馬錢科落葉灌木密蒙花樹的花蕾，性甘，微寒，歸肝經(jīng)；有清熱（瀉火）養(yǎng)肝，明目退翳之功效；主治目赤翳障，目昏干澀等癥。密蒙花在中醫(yī)眼科古籍中作為君藥早有治療干眼癥的論述，如密蒙花散?，F(xiàn)代對(duì)密蒙花的研究發(fā)現(xiàn)：密蒙花含有刺槐素、密蒙花苷、密蒙花萜苷、木犀草素等。其中小鼠口服刺槐素能減輕甲醛性炎癥，還能降低皮膚、小腸血管的通透性及脆性[9]。其抗炎成分為總黃酮和苯乙醇苷[10]。用放射性示蹤標(biāo)記方法研究還表明密蒙花提取物中含有大量黃酮類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)是細(xì)胞膜雄激素受體的刺激物，可以與細(xì)胞膜雄激素受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[11]。密蒙花中的黃酮類化合物可與淚腺、角膜等眼表組織中的雄激素受體結(jié)合[12]。近期研究表明：密蒙花黃酮類提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性雄激素水平下降所致干眼癥有良好的治療效果，其機(jī)制主要與密蒙花黃酮能夠有效調(diào)節(jié)淚腺局部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，上調(diào)TGF-β1mRNA的表達(dá)以增加TGF-β1的合成等有關(guān)，能改善淚腺組織結(jié)構(gòu)，從而維持淚液基礎(chǔ)分泌量[13-19]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組淚腺組織中IL-1β的表達(dá)顯著升高，同時(shí)，透射電鏡下可見淚腺組織中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞[20]。由此說明，去勢(shì)導(dǎo)致的雄激素水平下降而使IL-1β的生成明顯增加，致使淚腺局部產(chǎn)生細(xì)胞炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致干眼癥。而丙酸睪酮組肌注丙酸睪酮較模型組明顯要低，說明雄激素治療干眼癥主要是通過免疫抑制作用而起到治療作用。本研究表明，密蒙花總黃酮可通過抑制IL-1β的合成而延緩3個(gè)月及5個(gè)月后雄激素水平下降所致干眼癥的進(jìn)展，密蒙花總黃酮抑制IL-1β水平可能是干眼癥中其抑制淚腺組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制之一。

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