非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用

楊吉飛，關(guān)貴全，劉志杰，汪月鳳，李有全，馬米玲，劉愛(ài)紅，任巧云，茍惠天，杜鵬飛，羅建勛，殷 宏

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動(dòng)物寄生蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒科的唯一成員非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、發(fā)熱、傳染性很高的疾病[1]。家豬和歐洲野豬普遍易感，呈現(xiàn)復(fù)雜的臨床癥狀，在家豬中是一種高度接觸性傳播疫病[2-4]。該病發(fā)病過(guò)程短，潛伏期5～15 d，有很高的發(fā)病率和死亡率，死亡率甚至可高達(dá)100%。目前，發(fā)生非洲豬瘟疫情必須上報(bào)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (OIE), 該病是引起感染國(guó)家和地區(qū)巨大經(jīng)濟(jì)損失的動(dòng)物疫病之一。目前，中國(guó)尚無(wú)該病的報(bào)道，但是一旦該病進(jìn)入將會(huì)引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ASF沒(méi)有相應(yīng)的治療措施和有效的疫苗，對(duì)于該病的控制主要依賴快速可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷和嚴(yán)格的防控措施。因此，建立ASF快速、準(zhǔn)確的診斷方法尤為重要。

1921年，非洲豬瘟最早在肯尼亞報(bào)道，引起家豬100% 的死亡[5]。此后，該病一直在非洲流行，直到1957年，由于給豬飼喂航班上的垃圾和剩余食物引起該病在葡萄牙的爆發(fā)[6]。非洲豬瘟隨后在歐洲的其他一些國(guó)家蔓延，包括馬耳他 (1978)、意大利 (1967、1980)、法國(guó) (1964、1967、1977)、比利時(shí)(1985)和荷蘭（1986）。但是隨后，除撒丁島外，該病在這些國(guó)家相繼被消滅[7]。從2005年到2010年，全世界共有25個(gè)國(guó)家報(bào)道有非洲豬瘟的爆發(fā)，主要包括非洲國(guó)家以及意大利、俄羅斯等歐洲國(guó)家[8]。

2007年，非洲豬瘟傳入高加索地區(qū)的格魯吉亞，并且迅速蔓延到相鄰的國(guó)家，包括亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯[9]。野豬的感染以及傳播媒介的存在使得該病的防控變得比較復(fù)雜[10]。目前，非洲豬瘟在俄羅斯持續(xù)存在和蔓延，從2007年1月到2010年11月，俄羅斯共爆發(fā)非洲豬瘟173起，2010年1月～11月共爆發(fā)73起，其爆發(fā)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[11]。中國(guó)與俄羅斯存在4300多千米的邊境線，使得中國(guó)防范非洲豬瘟的傳入面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

非洲豬瘟感染顯示不同的臨床表現(xiàn)型，急性和亞急型病例與其他豬的出血性疾病相似，因此對(duì)于該病的實(shí)驗(yàn)室診斷尤為重要。到目前為止, 非洲豬瘟病毒的分子檢測(cè)方法包括常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)、古典豬瘟-非洲豬瘟多重PCR檢測(cè)技術(shù)等方法[12-14]，由于中國(guó)尚無(wú)該病的報(bào)道，對(duì)于該病的研究相對(duì)比較少。為有效防控該病進(jìn)入我國(guó)，建立一種敏感性高，特異性好、易操作的檢測(cè)技術(shù)尤為重要。2000年, 日本科學(xué)家Notomi等發(fā)明了一種敏感性很高的DNA擴(kuò)增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)[15]，該方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)的特異性較高，所需反應(yīng)時(shí)間較短。根據(jù)LAMP反應(yīng)的這些特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該技術(shù)，基于非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白vp72基因建立非洲豬瘟病毒的LAMP檢測(cè)技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 PCR儀 購(gòu)于BIO-RAD公司；凝膠成像儀購(gòu)于上海培清科技有限公司；恒溫水浴鍋購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；基因組提取試劑盒、dNTP購(gòu)于Roche Diagnostics公司；Taq Gold DNA 聚合酶、10倍PCR Buffer II以及MgCl2購(gòu)于 Applied Biosystems公司；Bst DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品；甜菜堿為Sigma公司產(chǎn)品；pGEM-Teasy載體為Promega公司產(chǎn)品；分子量標(biāo)記為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 樣品及基因組 非洲豬瘟病毒17個(gè)毒株的基因組由西班牙食品與農(nóng)業(yè)技術(shù)研究院動(dòng)物健康研究中心（CISA-INIA）、歐盟非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬水泡病病毒基因組以及cDNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所病毒病研究室提供；偽狂犬病毒基因組由購(gòu)買的活疫苗提??；副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌的基因組由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病研究室提供；豬衣原體基因組由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所人獸共患病研究室提供；豬野外樣品及蜱的基因組由本研究室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及序列 根據(jù)NCBI公布的序列及DNAStar軟件分析的結(jié)果，基于非洲豬瘟病毒vp72基因，應(yīng)用序列“AY578689”，使用PrimerExploerV4軟 件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP特異性引物。本研究中所使用的PCR引物序列為OIE參考PCR方法中的引物[13]，引物序列由Invitrogen公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 LAMP和PCR引物序列表Table 1 Sequences of primers for LAMP and PCR

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 本研究中所使用的重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物，從非洲豬瘟病毒E70分離株基因組擴(kuò)增含有vp72基因的目的片段，連接至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞后測(cè)序。

1.5 LAMP及OIE-PCR反應(yīng)體系 LAMP及PCR擴(kuò)增反應(yīng)均在25 μL體系中進(jìn)行。LAMP反應(yīng)體系中包括: 12.5 μL LAMP反應(yīng)緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、20 mmol/L KCl、16 mmol/L MgSO4、20 mmol/L (NH4)2SO4、0.2% Tween 20、1.6 mol/L甜菜堿、2.8 mmol/L dNTPs)、0.9 μL引物混合液(40 pmol FIP、BIP、20 pmol LF、LB、5 pmol F3、B3)、2.0 μL DNA 樣 品、1.0 μL (8U) Bst DNA聚合酶(New England Biolabs, M0275L)和8.2 μ L滅菌水。OIE-PCR反應(yīng)體系包括：17.375μ L滅菌水、 2.5μ L 10 × PCR Buffer II、2 μ L MgCl2(25 mmol/L)、0.5 μ L dNTP 混 合 液 (10mmol/L)、0.25 μ L 引 物 PPA-1 和 PPA-2(20 pmol/μ L)、2.0 μ L DNA樣品、0.125 μ L Taq Gold DNA聚合酶(5 U/μ L)。

1.6 LAMP反應(yīng)條件測(cè)定 LAMP反應(yīng)的條件一般選擇在60°C～65°C條件下進(jìn)行，擴(kuò)增的時(shí)間大約在30～60 min范圍內(nèi)。根據(jù)所設(shè)計(jì)的LAMP特異性引物, 選擇可以將非洲豬瘟病毒基因組擴(kuò)增的最佳反應(yīng)條件。

1.7 OIE-PCR反應(yīng)條件 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 預(yù)變性10 min；95°C 變性15 s，62°C 退火30 s，72°C 延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)；72°C 再延伸 7 min。

1.8 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序鑒定 將非洲豬瘟病毒LAMP特異性引物的F2：5'-CCAAATCCTTTTGCGATG C-3'，B1c：5'-TCTCGTTAAACCAAAAGCGC AG-3'做為PCR擴(kuò)增的引物。將LAMP擴(kuò)增的產(chǎn)物50倍稀釋，用引物F2和B1c進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在50 μL體系中進(jìn)行，包含滅菌去離子水 37.7 μL、10 × PCR buffer(plus Mg2+) 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mixture 4 μL、上下游引物各1 μL、LAMP反應(yīng)產(chǎn)物模板1 μL、Taq DNA聚合酶 (5 U/μL) 0.3 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 94°C預(yù)變性4 min；94°C變性30 s, 60°C退火30 s, 72°C延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72°C再延伸7 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，連接至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞后，菌液送去測(cè)序。

1.9 LAMP反應(yīng)特異性 以豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬水泡病病毒、副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌、豬衣原體、健康豬和蜱的基因組以及cDNA為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)LAMP反應(yīng)的特異性。

1.10 LAMP反應(yīng)敏感性 將含有非洲豬瘟病毒vp72基因的重組質(zhì)粒pGEM-T-vp72-E70定量到1 ng/μL, 倍比稀釋，檢測(cè)LAMP反應(yīng)的敏感性，并且與OIE參考的PCR方法進(jìn)行平行比較。

1.11 LAMP方法的應(yīng)用 應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物對(duì)歐盟非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)的非洲豬瘟病毒17個(gè)毒株的基因組以及本實(shí)驗(yàn)室保存的50份豬和30份蜱的野外樣品基因組進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室所設(shè)計(jì)的引物，以非洲豬瘟病毒分離株E70為模板，擴(kuò)增目的片段，構(gòu)建含有非洲豬瘟病毒vp72基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR方法鑒定和測(cè)序分析，顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有非洲豬瘟病毒vp72基因的完整序列，命名為pGEM-T-vp72-E70。

2.2 LAMP反應(yīng)條件選擇結(jié)果 根據(jù)所設(shè)計(jì)的LAMP引物, 選擇用于非洲豬瘟病毒檢測(cè)的最佳反應(yīng)條件,結(jié)果表明，最佳反應(yīng)條件為：65°C水浴鍋中擴(kuò)增60 min，反應(yīng)擴(kuò)增完成后立刻轉(zhuǎn)入80°C水浴鍋中滅活2 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL, 以TAE為緩沖液,在2%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠) 中,在電壓75 V電泳中進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 LAMP反應(yīng)結(jié)果 如圖1所示, 本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的特異性引物在特定的條件下可以對(duì)含有非洲豬瘟病毒vp72基因的重組質(zhì)粒pGEM-T-vp72-E70進(jìn)行擴(kuò)增。

圖1 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果Fig.1 Amplif i cation of ASFV by LAMP

2.4 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果 LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后, 將擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI上面已提交的序列比對(duì)顯示正確。

2.5 LAMP特異性結(jié)果 LAMP技術(shù)用于非洲豬瘟病毒vp72基因的檢測(cè), 其電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。所設(shè)計(jì)的LAMP引物只能將含有非洲豬瘟病毒vp72基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)照組所有樣品均為陰性, 表明該引物分別與豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬水泡病病毒、副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌、豬衣原體、健康豬和蜱的基因組以及cDNA均沒(méi)有交叉反應(yīng),設(shè)計(jì)的引物具有很好的特異性, 該方法可以用于對(duì)非洲豬瘟病毒的檢測(cè)。

圖2 非洲豬瘟病毒LAMP特異性結(jié)果Fig.2 Specif i city of LAMP for ASFV detection

圖3 非洲豬瘟病毒LAMP與PCR敏感性比較結(jié)果Fig.3 Sensitivity comparisons of LAMP and PCR for ASFV detection

2.6 LAMP敏感性結(jié)果 應(yīng)用特異性引物對(duì)已定量的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增, 并且與OIE參考的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行比較。LAMP反應(yīng)的敏感性如圖3所示。非洲豬瘟病毒特異性的LAMP引物可以檢測(cè)到2 fg的重組質(zhì)粒(pGEM-T-vp72-E70) DNA（圖A）；OIE參考的PCR引物可以檢測(cè)到0.2 fg的重組質(zhì)粒(pGEM-T-vp72-E70) DNA（圖B）。

2.7 LAMP方法的應(yīng)用 本研究所建立的非洲豬瘟病毒LAMP方法能夠?qū)⒖紝?shí)驗(yàn)室提供的非洲豬瘟病毒17個(gè)毒株的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生具有特征性的陽(yáng)性結(jié)果；中國(guó)收集的50份豬的基因組以及30份蜱的野外樣品基因組檢測(cè)結(jié)果均為陰性。本研究中所檢測(cè)的非洲豬瘟病毒17個(gè)毒株見(jiàn)下表2。

表2 非洲豬瘟病毒參考毒株Table 2 African Swine Fever Virus reference strains

3 討論

非洲豬瘟的爆發(fā)和流行對(duì)感染國(guó)家和地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于世界經(jīng)濟(jì)貿(mào)易、人員往來(lái)等因素，很多無(wú)非洲豬瘟疫病的國(guó)家面臨著該病傳入的危險(xiǎn)局面。2007年，該病進(jìn)入高加索地區(qū)以來(lái)，俄羅斯持續(xù)爆發(fā)非洲豬瘟疫情。2010年1月到11月，俄羅斯共爆發(fā)73起非洲豬瘟疫情中，可疑動(dòng)物73 819頭，病例4750例，死亡1088，共淘汰豬58 450頭[16]。野豬的存在以及豬產(chǎn)品貿(mào)易使得該病在俄羅斯持續(xù)存在和蔓延，對(duì)周邊國(guó)家產(chǎn)生了巨大的威脅。

非洲豬瘟在臨床上與豬的其他出血性疾病，比如古典豬瘟、高致病性藍(lán)耳病、偽狂犬病等很難進(jìn)行區(qū)分[17]，并且由于非洲豬瘟病毒有22個(gè)基因型[18]，引起的臨床癥狀較為復(fù)雜，根據(jù)臨床表現(xiàn)很難完成對(duì)該病的確診，建立一種簡(jiǎn)單可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)尤為重要。vp72基因是非洲豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因，不同毒株之間的差異較小，因此，本研究基于非洲豬瘟病毒vp72基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)非洲豬瘟病毒特異性核酸的LAMP技術(shù)，并且應(yīng)用本研究所建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)與OIE參考的PCR方法進(jìn)行比較。研究結(jié)果顯示，本研究中所設(shè)計(jì)的引物具有很好的特異性，與豬的其他病毒病和細(xì)菌病病原以及健康豬和蜱之間均沒(méi)有交叉反應(yīng)。敏感性結(jié)果顯示，本研究所建立的LAMP方法敏感性略低于OIE參考的PCR方法，但是非洲豬瘟病毒感染產(chǎn)生較高的病毒血癥[19]，通?？梢栽诟腥镜牡诙炷軌驈难褐袡z出[13]，并不會(huì)影響該檢測(cè)技術(shù)在該病檢測(cè)中的應(yīng)用，并且LAMP技術(shù)應(yīng)用于核酸檢測(cè)具有特異性高、快速、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，因此，該技術(shù)能夠用于非洲豬瘟病毒的檢測(cè)。雖然國(guó)外已有該技術(shù)用于非洲豬瘟病毒檢測(cè)的報(bào)道[20]，但是基于各國(guó)豬病的疫情及流行毒株與我國(guó)存在差異，必須建立適用于我國(guó)、并且可以與我國(guó)流行的其他豬病病原區(qū)分的檢測(cè)方法；國(guó)內(nèi)的相關(guān)報(bào)道均基于單一合成的含有vp72基因的重組質(zhì)粒[21,22]，本研究中應(yīng)用非洲豬瘟病毒的全基因組，全基因組共包括不同國(guó)家和地區(qū)、不同爆發(fā)時(shí)間17個(gè)非洲豬瘟病毒分離株的基因組，保證了該方法的特異性和敏感性。根據(jù)本研究，引物是LAMP技術(shù)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，本研究通過(guò)序列比對(duì)、軟件分析設(shè)計(jì)了多套引物，在保證特異性、敏感性的基礎(chǔ)上，經(jīng)多次重復(fù)篩選，選出了比較穩(wěn)定、可用于該病檢測(cè)的一套引物。

本研究中參考的OIE-PCR方法完全按照“非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室” SOP所規(guī)定的試劑以及操作程序進(jìn)行，反映出了本研究所建立方法的有效性。應(yīng)用本研究所建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)，能夠有效擴(kuò)增非洲豬瘟病毒17個(gè)毒株的基因組，而對(duì)我國(guó)收集的50份豬的基因組、30份蜱的野外樣品基因組檢測(cè)均為陰性。在參考實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)的非洲豬瘟病毒基因組中，包括2007年分離自亞美尼亞的非洲豬瘟病毒基因Ⅱ型（Arm07），基于LAMP技術(shù)本身的一些優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)可以用于與俄羅斯接壤地區(qū)的疫情監(jiān)控。

基于上述研究結(jié)果，本研究基于非洲豬瘟病毒vp72基因所建立的LAMP技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè)，可以有效地用于非洲豬瘟的快速診斷以及防控，為防止該病進(jìn)入我國(guó)奠定一定的基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用前景。

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