三種鑒別診斷PRRSV美洲型經(jīng)典毒株和變異株的方法比較

陳仕龍，陳少鶯，江 斌，林鋒強，朱小麗，王 劭，程曉霞，黃梅清，李兆龍，鄭 敏

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013）

豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱豬藍耳病）(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以成年母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為主要癥狀的豬傳染病。PRRSV分為美洲型和歐洲型兩個基因型[1,2]。1996年以來，中國流行的是美洲型PRRSV[3]。2006年以來流行于中國的豬高熱病，是由美洲型PRRSV變異株引起的一種急性高致死性疫病，對各日齡豬均敏感，主要表現(xiàn)為豬高熱(41℃以上)、高發(fā)病率、高死亡率、低治愈率。

美洲型傳統(tǒng)毒株和變異株鑒別診斷方法有RTPCR、熒光定量PCR及免疫熒光等方法。本文在建立間接免疫熒光（indirect fluorescent antibody test,IFA）鑒別診斷方法的基礎(chǔ)上[4]，研制出免疫熒光鑒別診斷試劑盒。為了驗證該免疫熒光診斷試劑盒的準確性、敏感性和實用性，本研究對臨床送檢的疑似病例及人工感染病料進行了RT-PCR、直接免疫熒光檢測及病毒分離3種方法的檢測，以期對各種診斷方法進行綜合評價，旨在篩選出能適合各類型PRRS診斷的實用方法。

1 材料與方法

1.1 病料采集及處理 來源于福建省福清、長樂、南平等地區(qū)疑似PRRS病例87份。無菌采集病死豬的肺臟、肺門淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等組織和，剪碎研磨，以Hank’s液制成1:5勻漿，加雙抗各1000 U，4℃過夜，凍融3次，1600×g離心20 min，取上清液用于病毒分離及RT-PCR檢測。采集疑似PRRS病料的肺臟和肺門淋巴結(jié)，制備冰凍切片，用于DFA檢測。

1.2 試劑及毒株 美洲型PRRSV傳統(tǒng)毒株和變異株免疫熒光鑒別診斷試劑盒由本試驗室制備，主要包括只能識別傳統(tǒng)美洲型PRRSV 的熒光單抗A61及既能識別傳統(tǒng)美洲型又能識別變異型PRRSV的熒光單抗C65；RT-PCR鑒別診斷試劑盒購自北京博德安晟商貿(mào)發(fā)展有限公司；傳統(tǒng)美洲型毒株P(guān)RRSV-FZ及美洲型變異株P(guān)RRSV-FJ0605由本實驗室分離、鑒定、保存。

1.3 病料的直接免疫熒光檢測(direct immunof l uorescence assay, DFA)檢測 取病料的冰凍切片，按本試驗室制備免疫熒光鑒別診斷試劑盒的方法進行DFA檢測，即切片加入1%BSA-PBS稀釋的A61/C65熒光單抗，37℃作用30 min后，用PBS充分洗滌，甘油-PBS封片后鏡檢觀察。若A61、C65熒光單抗加樣組都為陽性反應(yīng)，則為美洲型PRRSV傳統(tǒng)毒株感染；若僅有C65熒光單抗組為陽性反應(yīng)，則為美洲型PRRSV變異株感染；若A61熒光單抗為陽性反應(yīng)，而C65熒光單抗為陰性，則結(jié)果無效。

1.4 病料的RT-PCR檢測 取病料勻漿按常規(guī)方法提取病毒核酸，按照試劑盒的說明進行RT-PCR試驗，擴增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，出現(xiàn)511 bp特異性條帶的為傳統(tǒng)美洲型PRRSV毒株感染，擴增出421 bp特異性條帶的為美洲型PRRSV變異株感染，并將擴增產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測序驗證。

1.5 病毒分離（virus isolation, VI） 取 DFA及RT-PCR檢測均為變異型PRRS的陽性病料5份，DFA及RT-PCR檢測均為傳統(tǒng)型PRRS的陽性病料5份，DFA及RT-PCR檢測均為陰性的病料5份在Marc145細胞單層中進行病毒分離。當出現(xiàn)細胞病變或盲傳3代時用RT-PCR鑒別診斷試劑盒進行驗證。

1.6 PRRSV人工感染豬及病料的采集 選取28日齡、PRRSV抗體陰性健康仔豬12頭，隨機分成3組，4頭/組。第一組用美洲型變異株P(guān)RRSV-FJ0605第7代病毒培養(yǎng)物（104.0TCID50/mL）經(jīng)滴鼻、肌注途徑接種，劑量為2 mL/頭；第二組用傳統(tǒng)美洲株P(guān)RRSV-FZ（104.5TCID50/mL）經(jīng)滴鼻、肌注途徑接種，劑量為2 mL/頭；第三組為未攻毒健康對照豬。三組隔離飼養(yǎng)，每日觀察臨床反應(yīng)、測定直腸體溫。于病毒接種后d 8每組剖殺2頭，d 14剖殺2頭，采集肺臟、肺門淋巴結(jié)等臟器，制作冰凍切片和組織勻漿，用于病毒分離、免疫熒光檢測、RT-PCR檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 疑似病料的DFA檢測 采用實驗室試制的PRRS DFA鑒別診斷試劑盒對臨床疑似PRRS疫情的87份病料進行檢測，PRRS總陽性數(shù)37份，陽性率為43%；其中變異型PRRS有24份，占PRRS陽性率的65%，傳統(tǒng)美洲型PRRS 13份，占PRRS陽性率的35%；50份樣品檢測為陰性。淋巴節(jié)及肺臟切片的陽性熒光反應(yīng)見圖1 A-D。

圖1 淋巴節(jié)及肺臟切片的陽性熒光反應(yīng)（200×）Fig.1 The positive reaction of Lymph node and lung by DFA (200×)

2.2 疑似病料的RT-PCR檢測及與DFA的符合率比較 采用RT-PCR鑒別診斷試劑盒對87份疑似病料進行平行檢測，結(jié)果PRRSV總陽性數(shù)為39份，陽性率為45%；其中變異型PRRSV有24份，占PRRS陽性率的62%，傳統(tǒng)美洲型PRRS 15份，占PRRS陽性率的38%；48份樣品檢測為陰性。經(jīng)過對擴增產(chǎn)物的測序驗證，凡是擴增出421bp特異性條帶的毒株在Nsp2區(qū)域有兩處基因，共缺失30個氨基酸，符合美洲型PRRSV變異株的特征；凡是擴增出511 bp片段的毒株，在Nsp2區(qū)域不存在缺失，符合傳統(tǒng)PRRSV毒株的特征。DFA與RTPCR檢測變異性PRRS的符合率為100%，DFA與RT-PCR檢測傳統(tǒng)型PRRS的陽性符合率為87%（13/15），DFA與RT-PCR的陰性符合率為96%（48/50），DFA與RT-PCR檢測臨床疑似病料的總符合率為94.3%。

2.3 臨床確診病料的病毒分離 結(jié)果5份變異型PRRS病料病毒分離均為陽性；5份傳統(tǒng)型PRRS病料，只有4份病毒分離為陽性；5份PRRS陰性病料病毒分離都為陰性。

2.4 PRRSV人工感染豬的臨床表現(xiàn) PRRSVFJ0605接種后2～3d，仔豬開始陸續(xù)發(fā)熱，直腸溫度達40.5℃～42.5℃，持續(xù)高熱9～12 d。病程前期臨床表現(xiàn)為：食欲不振、精神沉郁、眼瞼水腫、皮膚充血、嚴重的呼吸困難，病豬瀕死。PRRSV-FZ組感染組病情較輕，體溫略升高（39.3℃～40.6℃），仔豬咳嗽、采食減少，未見死亡；陰性對照豬在觀察期間未見異常。

圖2 傳統(tǒng)美洲型和變異型PRRSV毒株的RT-PCR鑒定圖Fig.2 PRRSV’s identif i cation by RT-PCR differential diagnosis kit

2.5 人工感染豬DFA、RT-PCR及VI三種方法的平行檢測 分別采集每頭攻毒豬的肺臟、淋巴結(jié)、腎臟等組織，制成勻漿在Marc145細胞中進行病毒分離，待出現(xiàn)細胞病變時，用PRRSV單抗進行免疫熒光驗證；取攻毒豬內(nèi)臟勻漿，提取核酸，按照PRRSV RT-PCR鑒別診斷試劑盒進行檢測；取攻毒豬肺臟及肺門淋巴結(jié)，制備冰凍切片，用于DFA檢測。結(jié)果，變異株攻毒組4頭豬病毒分離、DFA和RT-PCR檢測均為陽性。傳統(tǒng)美洲株攻毒組4頭豬RT-PCR均為陽性，而VI及DFA檢測均是3頭陽性。

2.6 人工感染和確診病料DFA檢測與VI及RTPCR檢測的符合率比較 本研究共對12份人工感染病料及15份臨床確診病料進行了DFA與VI及RT-PCR的符合率統(tǒng)計，見表1。變異型PRRS 9份，病毒分離、RT-PCR和DFA檢測均為陽性。傳統(tǒng)型PRRS 9份，病毒分離陽性數(shù)7份，陰性2份；DFA檢測陽性數(shù)8份，陰性1份；RT-PCR檢測都是陽性。9份陰性病料三種方法檢測都是陰性。DFA與VI的陽性符合率為94%（16/17），陰性符合率為91%（10/11），DFA與VI的總符合率為92.5%。DFA與RT-PCR之間的陽性符合率為94%（17/18），陰性符合率為90%（9/10），DFA與RT-PCR之間的總符合率為92.2%。

表1 三種方法對12份人工感染和15份確診病料檢測結(jié)果的比較Table 1 The comparison of three diagnostic methods for detecting classical PRRSV and variant PRRSV

2.7 本研究用自己研制PRRS鑒別診斷DFA試劑盒、RT-PCR鑒別診斷試劑盒及VI 3種診斷方法對臨床疑似病例及人工感染病料進行檢測，并進行符合率比較，以期為我國正流行的傳統(tǒng)美洲型PRRS和變異型PRRS的鑒別診斷提供理論依據(jù)。結(jié)果，RTPCR敏感性最強，DFA次之，VI最差。DFA免疫熒光診斷法與病毒分離的符合率達92.5%，與商品化的RT-PCR診斷試劑盒之間的符合率為92.2%。說明我們研制的DFA診斷試劑盒試驗結(jié)果可靠，敏感性強，可用于臨床各類型PRRS的確診。

本研究應(yīng)用3種方法對疑似病例及人工感染病料檢測發(fā)現(xiàn)，變異型PRRSV毒株比傳統(tǒng)PRRSV毒株更易病毒分離成功。我們對人工感染病例各器官檢測也發(fā)現(xiàn)，變異型PRRSV廣泛分布于各個器官，而傳統(tǒng)美洲型PRRSV毒株則主要分布在肺臟、淋巴結(jié)等器官。這在一定程度上解釋了PRRSV變異株的致病性、傳染性高于傳統(tǒng)美洲型PRRS的原因。

要從根本上預(yù)防和消滅PRRSV，研制快速、簡便且適于基層推廣應(yīng)用的診斷試劑具有重要的社會意義。傳統(tǒng)PRRSV和變異型PRRSV鑒別診斷的RT-PCR 試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒，具有敏感性強、檢測時間較短(5～10 h 得出結(jié)果) 等優(yōu)點，但試驗成本較高，操作繁瑣、需要較多的儀器設(shè)備，不適合獸醫(yī)臨床和基層對PRRS的快速診斷，且核酸樣品容易交叉污染，出現(xiàn)假陰性，造成陰性檢查出率過高的現(xiàn)象。病毒分離是診斷病毒性疾病的金標準，特異性強，常用于新診斷試劑的評價；但耗時長，敏感性不高，成本和技術(shù)要求高，且陽性分離物還需要借助其它方法進行驗證，一般適用于技術(shù)和設(shè)備較好的科研機構(gòu)的回顧性診斷[5]。本項目組研制的鑒別傳統(tǒng)美洲型PRRSV和變異型PRRSV的DFA試劑盒簡便、快速、特異性強、成本低，適用于各類PRRS疫情的快速診斷、鑒別、流行病學(xué)調(diào)查等，特別是對采集不及時或死亡時間過長等樣品的檢測具有較強的優(yōu)勢，彌補了RT-PCR、VI等檢測方法過程復(fù)雜，費時費力的缺陷。但是該DFA試劑盒需配備熒光顯微鏡、冰凍切片機，操作人員要有一定的經(jīng)驗，樣品處理方法為冰凍切片，不適宜做活體檢測，限制其進一步的推廣應(yīng)用。以后應(yīng)加強該熒光診斷試劑盒在活體或死后組織觸片的應(yīng)用研究，使建立的DFA診斷方法更簡單和實用。

[1] 陳仕龍, 林天龍, 陳少鶯, 等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的制備與特性分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2008, 36(8): 45-50.

[2] 黃梅清, 車勇良, 陳少鶯, 等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型FJ0602 株的分離及其ORF7 的序列分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2008, 30(3): 174-178.

[3]郭寶清, 陳章水, 劉文興, 等.從疑似PRRS 流產(chǎn)胎兒分離PRRSV 的研究[J].中國畜禽傳染病, 1996, 18(2): 124.

[4]陳仕龍, 黃梅清, 林天龍, 等.高致病性豬生殖與呼吸綜合征病毒間接免疫熒光鑒別方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué), 2009, 39(1): 41-44.

[5]王向鵬, 張興娟, 孫元, 等.六種檢測豬瘟病毒方法的比較[J].微生物學(xué)報, 2010, 50(8): 1087-1093.