重組日本血吸蟲抱雌溝蛋白誘導的免疫機制研究

李 東 ，朱 珠 ，石耀軍 ，陸 柯 ，彭金彪 ，洪 煬 ，張 旻 ，韓彥輝

（1.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241）

血吸蟲病是僅次于瘧疾的第二大熱帶病。血吸蟲終末宿主種類多以及中間宿主－釘螺分布廣等因素給血吸蟲病的防控帶來很大困難?，F(xiàn)在廣泛使用的吡喹酮化療對病人、病畜雖有較好的效果，但不能阻止重復感染，加之長期反復使用可使血吸蟲產(chǎn)生耐藥性，所以，加強血吸蟲病的疫苗研究是不可或缺的發(fā)展戰(zhàn)略。

血吸蟲基因工程疫苗研究已取得較大進展，發(fā)現(xiàn)了一些具有較高潛力的候選疫苗抗原分子，但迄今為止還未研制出一種穩(wěn)定的具有高保護力的疫苗[1]。下一步的研究方向一方面是繼續(xù)尋找新的疫苗候選分子，另一方面是對已篩選抗原開展佐劑篩選、免疫程序及免疫機理研究，以進一步提高其免疫保護效果。

血吸蟲為雌雄異體，在終末宿主體內(nèi)蟲體不增殖，雌雄蟲必須合抱后雌蟲才能性成熟，進而產(chǎn)卵[2]，蟲卵在肝臟內(nèi)部沉積形成肉芽腫是血吸蟲病的主要致病原因[3]。有研究表明，抱雌溝蛋白（Gynecophoral canal protein，GCP)基因是血吸蟲雄蟲特異性表達基因[4]，具有影響雌雄蟲體合抱的功能[5]。用重組日本血吸蟲抱雌溝蛋白（rSjGCP）免疫小鼠，可以誘導較高的減蟲率和減卵率。

本研究利用實驗室前期已構(gòu)建的抱雌溝蛋白重組表達質(zhì)粒pGEX-SjGCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行表達，純化得到與GST重組的融合蛋白，再分別以CFA/IFA、ISA206、ISA70M為佐劑免疫小鼠，通過流式細胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附檢測各免疫組T淋巴細胞亞群、細胞因子含量和特異性抗體水平，為了解重組SjGCP在小鼠體內(nèi)誘導的免疫保護機制積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和血吸蟲尾蚴 BALB/c小鼠，6～8周齡，購于中國科學院上海實驗動物研究中心；血吸蟲尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所提供，以新西蘭大白兔維系其生活史。

1.1.2 試劑和儀器 檢測淋巴細胞亞群熒光抗體及其同型對照購于美國BD Pharmingen公司；檢測淋巴細胞內(nèi)細胞因子熒光抗體及其同型對照購自美國BioLegend公司；免疫刺激劑購自美國Sigma公司；酶標二抗HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3購自英國AbD serotec公司；HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L)購 自美 國KPL公 司；HRP-conjugated antimouse IgM購自美國Bethyl公司；HRP-conjugated antimouse IgE、IgA購自美國SouthernBiotech公司；可溶性單組分TMB底物溶液購自北京天根生物科技有限公司。

流式細胞儀、37℃孵箱、混勻振蕩器、離心機、加樣器、Tips流式上樣管、酶標板購自美國Costar公司；酶標儀購自美國BioTek公司；流式細胞儀購自美國Beckman coulter公司

1.2 實驗方法

1.2.1 重組抱雌溝蛋白（rSjGCP）和載體表達蛋白GST的表達、純化 將本實驗室已構(gòu)建的含有pGEX-SjGCP質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pGEX-4T-2的菌株，以1:100比例分別接種于含Amp+的500 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)。當OD600達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導培養(yǎng)。當菌液OD值達到約2.0時，4℃，12 000×g離心10 min，收集菌體。加入15～20 mL PBST吹打至成為懸濁液，室溫-20℃反復凍融3次，380Hz，2秒×60次超聲破碎后，4℃，12 000×g離心10 min，分別收集沉淀和上清液，聚丙烯酰凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測蛋白表達情況。以8 mol/L尿素溶解含有pGEX-SjGCP質(zhì)粒菌沉淀，依次用含6、4、3、2、1、0 mol/L尿素的PBS進行梯度濃度透析。依據(jù)產(chǎn)品說明書用GST Bind Purification Kit分別對上述透析樣品及用含pGEX-4T-2的菌株制備上清中的目的蛋白進行純化。取純化后樣品20μL，進行常規(guī)SDS-PAGE，鑒定純度。用bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定濃度后分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠的免疫和感染 小鼠隨機分成10組，每組10只：PBS組，注射PBS；CFA/IFA佐劑組，注射CFA/IFA佐劑（第一次免疫以CFA作為佐劑，后兩次均用IFA）；ISA206佐劑組，注射ISA206佐劑；ISA70M佐劑組，注射ISA70M佐劑；GST-FCA組，注射載體表達蛋白GST與IFA/CFA佐劑；GST-206組，注射載體表達蛋白GST與ISA206佐劑；GST-70M組，注射載體表達蛋白GST與ISA70M佐劑； SjGCP- FCA組，注射重組蛋白SjGCP與IFA/CFA佐劑；SjGCP-206組，注射重組蛋白SjGCP與ISA206佐劑；SjGCP-70M組，注射重組蛋白SjGCP與ISA70M佐劑。小鼠免疫蛋白量為每只20 μg，免疫體積100 μL，佐劑與蛋白體積比分別為IFA/CFA 50:50、 ISA206 45:55、ISA 70M 35:65。分別在小鼠購入后的第2周、第4周和第6周進行3次皮下注射免疫。第3次免疫后1周，用(40±2)條日本血吸蟲尾蚴經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染，感染后6周剖殺。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測T細胞增值以及細胞因子表達 第3次免疫后1周，每組取3只小鼠，剖殺，取脾進行研磨。將3只小鼠脾臟分離淋巴細胞混勻，計數(shù)，取含有106個細胞的懸液，加PBS至終體積為100 μL，每組3個樣品重復，待檢測。

依照文獻[6]方法進行T細胞檢測，于樣本中加入特異性熒光抗體PE-Cy5 CD3e、PE-CD4、FITC-CD8a(BD, America)，同型對照組加入同型抗 體 PE-Cy5 IgG1、PE-IgG2b、FITC- IgG2a(BD,America)，混勻細胞，4℃避光孵育30 min；然后用1 mL PBS洗滌，1800×g離心5 min，反復洗滌3次，去除多余抗體。最后用0.6 mL PBS 重懸細胞，上機檢測。

依照文獻[7]所示方法進行細胞內(nèi)因子檢測，對于準備檢測細胞因子 IL-2、IL-4、IFN-r、IL-10（BD, America）的樣本組和同型對照組，分別加入PMA+ Ionomycin(BD, America）進行刺激，同時加 入 Monensin（BD, America)，37℃，5% CO2溫箱孵育4～6 h。然后進行細胞表面標記，各實驗組和對照組均加入特異性熒光抗體 PE-Cy5 CD3e、PE-Cy7CD8a(BD，America)，避光孵育30 min，加入1 mL PBS洗滌3次。表面標記完成后每管加入0.5 mL細胞固定液，避光固定15 min，棄上清后用破膜劑（約100 μL）重懸細胞，孵育20 min后在樣本中加入細胞因子特異性抗體FITC-IL-2、PEIL-4、FITC-IL-10、 FITC-IFN-r(BD, America) 染色，分別以PE- IgG1、PE-Cy5 IgG1、FITC- IgG1(BD, America)作為同型對照。最后室溫避光孵育20 min，PBS洗滌一次后用洗滌1次后用0.6 mL PBS重懸，上機檢測，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性抗體 分別于免疫前（0周)、三免后(6周）以及攻擊感染后6周(13周)收集血清，通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中特異性抗體(lgG及其亞型lgG1)水平。純化重組日本血吸蟲抱雌溝蛋白(SjGCP)和載體表達蛋白GST，分別用包被緩沖液稀釋至10 μg/mL，加入96孔板（100 μL /孔），4℃包被過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液（PBST）洗3次，每次5 min。洗滌后，孔內(nèi)加入含4%牛血清蛋白（BSA）的封閉緩沖液，37℃溫箱中封閉1 h。加入100 μL洗滌緩沖液稀釋的待檢血清，37℃孵育1 h后洗滌。再加入新稀釋的酶標羊抗鼠抗體（ABD Serotec, England）100 μL。稀釋度IgG 1:6000，IgG1為 1:4000。接下來加入TMB底物溶液（TIANGEN China）100 μL/孔，37℃反應(yīng)20 min。最后加入終止液（2 mol/L硫酸50 μL/孔）終止反應(yīng)。使用酶標檢測儀（BIO-TEC Synergy HT），于450nm 測定各孔吸光值（A）。實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析 使用SPSS 11.0軟件作為分析工具，分別通過T檢驗（Student’st-test）和單因素方差分析(ANOVA)來對比各個組之間的差異顯著性（P≤0.05)，所有數(shù)據(jù)以 ±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白rSjGCP及載體表達蛋白GST的純化 經(jīng)過GST Bind Purification Kit純化后，獲得了高純度的rSjGCP及載體表達蛋白GST，其SDSPAGE鑒定結(jié)果如如圖1所示。

2.2 T細胞亞群組成分析我 不同試驗組小鼠在第三次免疫之后取脾，研磨后熒光染色，通過流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞亞群占總的淋巴細胞的百分比。結(jié)果顯示，與PBS對照組比較，F(xiàn)CA/IFA佐劑組小鼠體內(nèi)CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞百分比顯著下降，而其CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升；ISA70M佐劑組其CD8+T淋巴細胞顯著下降，CD4+T淋巴細胞無顯著變化，而CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升；ISA206佐劑組CD4+T和CD8+T淋巴細胞無明顯變化。

圖1 純化重組蛋白rSjGCP和載體表達蛋白GST的SDSPAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purif i ed rSjGCP and GST

與PBS組比較，GCP-FCA組、GCP-206組和GST-206組小鼠 CD8+T淋巴細胞顯著下降，GST-206組、GST-70M組小鼠CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升，GCP-70M的CD4+T淋巴細胞顯著下降；而與相應(yīng)GST組比較GCP-FCA組、GCP-70M組小鼠 CD8+T淋巴細胞顯著下降，GCP-FCA組、GCP-70M組CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升（圖2、圖3）。

圖2 三免后組小鼠T淋巴細胞亞群組成分析Fig.2 The analysis of the composition of T lymphocyte subsets after the third immunity

注：* 與PBS組之間差異有統(tǒng)計學意義（P≤0.05）；# 與相應(yīng)的GST組之間差異有統(tǒng)計學意義（P≤0.05）

Note: * Signif i cant difference compared with PBS groups (P≤0.05); # Signif i cant difference compared with same adjuvant mixed withGST (P≤0.05)

圖3 三免后小鼠CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞比例分析Fig.3 The analysis of the value of CD4+T cells/CD8+ Tcells after the third immunity

2.3 細胞因子表達水平檢測結(jié)果 與PBS組小鼠比較，CFA/IFA佐劑組小鼠IL-4表達顯著升高；ISA206佐劑組IL-4、IL-10表達顯著升高；ISA70M組小鼠，但均未達到顯著性水平；GST-206組中IL-10表達顯著升高；GCP-FCA組和GCP-206組中IL-4、IL-10 表達水平均顯著上升；與相應(yīng)GST組比較，GCP-FCA組和GCP-206組中IL-4、IL-10 表達水平均顯著上升（圖4）。各組中IL-2、IFN-γ表達水平均有升高，但都未達到顯著性水平（圖5）。

圖4 三免后脾臟中分泌IL-4或IL-10的CD4+T淋巴細胞百分比Fig.4 The percentage of CD4+ T cells which secreted IL-4 or IL-10 after the third immunity in the spleen

圖5 三免后脾臟分泌IL-2或IFN-γCD4+T的淋巴細胞百分比Fig.5 The percentage of CD4+ T cells which secreted IL-2 or IFN-γ after the third immunity in the spleen

2.4 血清中抗體水平檢測 結(jié)果顯示，重組抗原免疫后，特異性抗體lgG1水平呈上升趨勢，其中三免后（6W）與PBS組比較，GCP-FCA組、GCP-206組、GCP-70M組特異性抗體lgG1顯著升高，感染后六周（13W）與PBS組比較GCP-206組、GCP-70M組特異性lgG1抗體仍然顯著性高表達；與相應(yīng)GST組比較，三免后（6W）GCP-FCA組、GCP-206組、GCP-70M組特異性抗體lgG1顯著升高，感染后六周（13W）GCP-206組特異性lgG1抗體仍然顯著性高表達。

3 討論

圖6 三次免疫后(6W)和感染六周后(13W)血液中抗體lgG1含量Fig.6 The level of lgG1 in the serum at 6 weeks( a week after the third immunity) and 13 weeks( 6 weeks after the infection)

研究表明，抱雌溝蛋白（Gynecophoral canal protein，GCP)基因是血吸蟲雄蟲特異性表達蛋白基因，且具有影響雌雄蟲體合抱的功能。在實驗動物免疫保護試驗中，SjGCP重組抗原或DNA疫苗誘導了部分的免疫保護效果。日本血吸蟲抱雌溝蛋白作為抗原免疫昆明系小鼠，獲得35.2%的減蟲率和37.8%肝臟減卵率[8]。以重組抱雌溝蛋白篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫獲得的陽性克隆免疫小鼠，分別獲得了40.53%、31.14%減蟲率以及35.31%、44.65%的減卵率[9]。將抱雌溝分泌蛋白保守區(qū)片段克隆到pcDNA3構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3-SjGCP，在小鼠日本血吸蟲病免疫保護試驗中，pcDNA3-SjGCP組的減蟲率為32.14%，減卵率為46.19%，與對照組pcDNA3相比差異顯著。以上結(jié)果均表明SjGCP是一個有潛力的血吸蟲疫苗候選抗原分子。

T淋巴細胞包括CD4+輔助性T淋巴細胞（Th細胞)、CD8+殺傷性T淋巴細胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞等。淋巴細胞中CD4+輔助性T淋巴細胞（Th細胞)和CD8+殺傷性T淋巴細胞（CTL細胞）的比值可以反映機體的免疫平衡狀態(tài)。本次試驗結(jié)果顯示，三次免疫后與PBS組相比，CFA/IFA佐劑組、GCP-70M組其CD4+T淋巴細胞百分比顯著降低，GCP-FCA組、GST-206組和GCP-206組小鼠CD8+T淋巴細胞百分比顯著下降；與GST組比較GCP-FCA組、GCP-70M組小鼠 CD8+T淋巴細胞百分比顯著下降。

免疫平衡是通過細胞因子和抗體等共同調(diào)節(jié)的，不同的細胞因子和抗體有不同的功能，這些細胞因子和抗體共同構(gòu)成了體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)：IL-2有刺激T淋巴細胞增殖分化的功能，同時誘導也Th0細胞向Th1細胞方向轉(zhuǎn)化。本研究中IL-2在各實驗組中表達均高于PBS組，但數(shù)據(jù)無顯著性差異。而IL-4可以抑制Th1型細胞分化，增強Th2型免疫反應(yīng)，IL-10則對IL-4過度表達有抑制作用[10]。GCP-FCA組、GCP-206組與PBS組和GST組比較IL-4和IL-10均顯著升高，顯示這幾組小鼠偏向于Th2的免疫狀態(tài)。而細胞因子IFN-γ對Th2型細胞分化均具有抑制作用[11-12]，本實驗中各實驗組IFN-γ含量與PBS組和相應(yīng)GST組比較沒有顯著性差異。

不同抗體也有不同的功能。實驗表明，用致弱尾蚴免疫狒狒和長尾猴，感染后其保護力水平與感染時宿主血清中的lgG水平呈現(xiàn)正相關(guān)，獲得最大保護力時lgG水平最高，抗體水平下降，保護力也下降。 抗體lgE以及抗體亞型IgG1在感染曼氏血吸蟲的人群中抵抗力有關(guān)[13]。本實驗中GCP-FCA組、GCP-206組和GCP-70M組三免后其IgG1水平顯著高于其PBS組和相應(yīng)GST組；感染六周后GCP-206組中IgG1仍較高且與其PBS組和相應(yīng)GST組比較有顯著性差異。

本研究對血吸蟲抱雌溝重組蛋白（SjGCP）免疫后小鼠的各種免疫效應(yīng)因子進行檢測分析，結(jié)果表明GCP-FCA、GCP-206免疫誘導了偏向于Th2型的免疫狀態(tài)。

[1] 汪世平, 陳秀春, 高冬梅.我國血吸蟲疫苗研究進展及應(yīng)用前景[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2009, 27(5):402-411.

[2] Gao Q, Feng Z H.Progress in the research on schistosome genome[J].Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases, 2000, 18(1): 52-54.

[3] Muschamp J W, Fong P P.Effects of the serotonin receptor ligand methiothepin on reproductive behavior of the freshwater snail Biomphalaria glabrata: Reduction of egg laying and induction of penile erection[J].Exp Zool, 2001,289 (3): 202-207.

[4] 朱建國,林矯矯, 馮新港, 等.日本血吸蟲編碼抱雌溝蛋白保守區(qū)cDNA核酸疫苗的研究[J].中國人獸共患病雜志, 2002, 18(3): 27-30.

[5] 程國鋒.日本血吸蟲性別差異蛋白質(zhì)組及抱雌溝蛋白基因功能研究[D].上海: 中國農(nóng)業(yè)科學院, 2005.

[6] Lyons A B, Parisha C R.Determination of lymphocyte division by flow cytometry[J].J Immunol Methods, 1994,171 (1) : 131-137.

[7] Pala P, Hussell T, Openshaw P J.Flow cytometric measurement of intracellular cytokines[J].J Immunol Methods, 2000 243(1-2) : 107-124.

[8] 朱建國.日本血吸蟲性別特異基因克隆表達及其免疫保護功能研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學院, 2001.

[9] 何金桃, 金亞美,劉金明, 等.日本血吸蟲抱雌溝蛋白篩選噬菌體展示抗原對小鼠血吸蟲病免疫效果觀察[J].新疆農(nóng)業(yè)大學學報, 2009, 32(5): 1-5.

[10] Hoffmann K F, Cheever A W, Wynn T A.IL-10 and the Dangers of immune polarization: excessive type 1 and type 2 cytokine responses induce distinct forms of lethal immunopathology in murine schistosomiasis[J].J Immunol, 2000, 164(12): 6406-6416.

[11] Pasquini S, Xiang Z, Wang Y,et al.Cytokines and costimulatory molecules as genetic adjuvants[J].Immunol Cell Biol.1997, 75(4): 397-401.

[12] Tran M H, Pearson M S, Bethony J M,et al.Tetraspanins on the surface of Schistosoma mansoni are protective antigens against schistosomiasis[J].Nat Med, 2006,12(7): 835-840.