TTMV間接ELISA檢測方法的建立

阿 榮, 武燕斌，劉志偉，李培鋒，楊志彪，崔 立,梁愛斌, 華修國

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018；2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240；3.上海同濟醫(yī)院血液科，上海 200065）

Torque teno mini virus (TTMV)首次由日本學者Shunji Mishiro 等在2000年初發(fā)現(xiàn)[1]，該病毒是一種新型單鏈環(huán)狀DNA病毒，病毒顆粒直徑小于30 nm[2]，其基因結(jié)構(gòu)類似于細環(huán)病毒（Torque teno virus, TTV）和雞貧血癥病毒（Chicken anemia virus, CAV），有2～3個開放讀碼框架(opening reading frame，ORF) ，ORF1和 ORF2 均在主鏈上，且較長的ORF1位于較短的ORF2之后, 二者有部分重疊[3]。TTMV由2765～2952 核苷酸組成，以感染人類為主，法國、挪威、巴西等國家均有在健康人血清中檢測到TTMV的報道[4-6]。除了感染人類，該病毒也可感染靈長類，而且在猩猩體內(nèi)感染率高達100%，在黑猩猩和長臂猿的體內(nèi)的感染率分別為80%和63%[7]。由于該病毒在種系上介于TTV與CAV之間，故被命名為TTV樣微小病毒（TTV-like mini virus，TLMV）[8]。2001年由國際委員會（ICTV）將其改名為Torque teno mini virus(TTMV)。2005年，病毒分類-國際病毒分類委員會（ICTV）將其單列為未定科的指環(huán)病毒屬成員（Anellovirida）[9]。

套式PCR及實時定量PCR是檢測TTMV的主要方法，而應用較為廣泛的血清學診斷方法——酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測TTMV尚未見報道[10]。因此，本研究以實驗室純化好的TTMV重組蛋白作為包被抗原，經(jīng)條件優(yōu)化，初步建立了一種簡便、經(jīng)濟、特異的檢測TTMV的間接ELISA 檢測方法，并應用于臨床血清樣品，為TTMV診斷試劑盒的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 辣根過氧化酶標記（HRP）的兔抗人IgG購自上海中科英沐生物科技有限公司；小牛血清白蛋白BSA、脫脂奶粉、可拆的ELISA板（COSTAR）購自上海東盛生物公司；可溶型TMB購自天根生物；明膠、人博卡病毒、人星狀病毒陽性血清、TTV陽性血清、HIV陽性血清等均由本實驗室保存；280份待檢血清樣品來自臨床病人（上海同濟醫(yī)院門診病人血清124份，遼寧錦州醫(yī)學院門診病人血清156份）。

1.2 間接ELISA方法的建立

1.2.1 TTMV標準血清樣本及抗原的制備 設計并合成環(huán)狀病毒通用引物，采用巢式PCR對血清樣品進行檢測，對陽性樣本利用特異性引物再進行巢式PCR檢測，以確定標準陽性血清樣品。在原核表達系統(tǒng)中表達TTMV中ORF1基因編碼蛋白（阿榮等，2001），經(jīng)蛋白純化樹脂Ni-NTA柱的純化及Western blot對蛋白活性進行分析后，測定蛋白濃度，-80℃保存。

1.2.2 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度確定 采用方陣滴定試驗確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。將純化的重組蛋白依次稀釋成3.26、1.63、0.80、0.40 μg/mL濃度包被酶標板。陽性血清和陰性血清分別做1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280稀釋，按常規(guī)ELISA方法操作，結(jié)果判定：以陽性血清OD450值在1.0且P/N值最大的抗原的稀釋倍數(shù)作為抗原最佳的工作濃度，對該點對應的血清稀釋度為最佳的血清稀釋度。

1.2.3 抗原包被條件的確定 以最佳抗原濃度包被ELISA板，每孔100 μL，分成3組。第1組：37℃包被2 h；第2組：37 ℃孵育1 h后4 ℃包被過夜；第3組：4 ℃包被過夜。三種不同包被條件下包被后，用TTMV標準陰性、陽性血清進行常規(guī)ELISA操作，測定OD450值和P/N值，以確定抗原的最佳包被條件。

1.2.4 最佳封閉液的選擇及封閉時間的確定 分別以5%脫脂奶粉、1% BSA、1%明膠作為封閉液加于ELISA板（均用PBS配制），100 μL/孔，37℃封閉2 h，用TTMV陰、陽性血清進行常規(guī)ELISA檢測。判定結(jié)果后，再將選定的封閉液分別在37℃封閉0.5、1、2 h，比較各組陰、陽性血清的OD450值和P/N值, 以確定最佳封閉時間。

1.2.5 血清最適作用時間的確定 用PBS將已知的陰、陽性血清做最佳稀釋倍數(shù)后，于37 ℃分別作用30、60、90 min，每個反應重復2次。在其它條件及操作方法相同的情況下，進行ELISA檢測，根據(jù)OD450值及P/N值確定最佳血清作用時間。

1.2.6 酶標二抗工作時間的確定 將酶標二抗做1:3000稀釋（按使用說明書），100 μL/孔，分別于37 ℃作用30、60、120 min，比較陰、陽性血清的OD450值和P/N值，以確定酶標二抗的最佳工作時間。

1.2.7 底物顯色時間的確定 按照既定的ELISA程序依次包被、封閉，加入陰、陽性血清，再和酶標二抗反應，之后加底物反應液顯色，室溫下分別設5、10、15 min后用終止液終止反應，每個反應重復3孔，讀取OD450值。根據(jù)OD450值及P/N值確定最佳底物顯色時間。

1.2.8 臨界值的確定 按上述建立的ELISA方法，對本實驗室保存的20份TTMV陰性血清進行檢測，經(jīng)統(tǒng)計學分析，得到OD450平均值(x) 和標準差(SD)。根據(jù)統(tǒng)計學原則，檢測樣本OD450≥x+3SD，判定為陽性。

1.3 特異性實驗 在間接ELISA反應條件下，用抗原包被酶標板分別對TTV陽性血清、人星狀病毒陽性血清、人博卡病毒陽性血清、HIV陽性血清做間接ELISA實驗，同時設TTMV陽性、陰性對照，以此來判斷是否存在交叉反應。

1.4 重復實驗 用同批次純化重組抗原包被同一塊ELISA板，對3份陽性血清和1份陰性血清樣本進行檢測，重復3個孔，測定OD450值, 計算變異系數(shù)(CV)，評價批內(nèi)重復試驗效果。用4塊不同時間包被的ELISA板，對已知的3份陽性血清和1份陰性血清樣品進行檢測，重復3個孔，測定OD450值,并計算變異系數(shù)(CV)，評價批間重復試驗效果。測方法，對上海市同濟醫(yī)院124份門診病人血清樣品和遼寧省錦州醫(yī)學院156份門診病人血清樣品進行檢測。

2 結(jié)果

1.5 臨床血清樣品的檢測 運用所建立的ELISA檢

2.1 間接ELISA方法的建立

2.1.1 抗原最佳包被濃度與血清最佳稀釋度的確定經(jīng)表達純化后的抗原終濃度為163 μg/mL，經(jīng)倍比稀釋后通過方陣滴定法確定抗原與血清的最佳濃度與稀釋度，當抗原的稀釋度為1:100（1.63 μg/mL）、血清稀釋倍數(shù)為1:320時，陽性血清OD450值接近1.0，P/N值最大。確定重組蛋白最佳包被濃度為1.63 μg/mL，血清最佳稀釋度為1:320 （表1）。

表1 重組蛋白抗原最適包被濃度與血清稀釋倍數(shù)的確定Table 1 Determination of the coating concentration of recombinant protein and serum dilution

2.1.2 抗原包被條件的確定 用檢測抗原1.63 μg/mL包被酶標板，以第二組的包被條件P/N值最高，達到7.89，結(jié)果表明，37 ℃ 1 h后4 ℃過夜是抗原的最佳包被條件（表2）。

表2 蛋白抗原包被條件的確定Table 2 Determination of the condition for coating of recombinant protein

2.1.3 最佳封閉液的選擇及封閉時間確定 由表3、4可知，以5%脫脂奶粉封閉液結(jié)果最理想，故選擇5%脫脂奶粉作為封閉液。封閉時間1 h和2 h效果無顯著差異，為了節(jié)省時間，故選擇封閉液1 h作為最佳封閉時間。2.1.4 血清最適作用時間 在室溫條件下，血清作用60 min與作用90 min檢測結(jié)果差異不顯著，而與作用30 min相比，檢測效果更好，從縮短檢測時間，提高檢測效率的角度來考慮，確定血清最佳作用時間為 37 ℃ 60 min (表 5) 。

表3 封閉液的確定Table 3 Determination for closing materials

表4 封閉時間的確定Table 4 Determination for closing time

表5 血清最佳作用時間的確定Table 5 Determination for optimum sera reaction time

2.1.5 酶標二抗工作時間的確定 酶標二抗作用時間為60 min時，陽性血清OD450值較大，且P/N值最大。因此選擇酶標二抗的最適作用時間為60 min(表6)。2.1.6 底物顯色時間的確定 底物作用10 min時，陽性血清OD值已達到0.8以上，且P/N值最大，作用時間超過15 min后，陰性血清OD值明顯上升。因此選擇底物顯色時間為10 min(表7)。

表6 酶標二抗最佳作用時間的確定Table 6 Determination for optimum Rabbit anti-human IgG/HRP reaction time

表7 底物最佳顯色時間的確定Table 7 Determination for optimum substrate reaction time

2.1.7 臨界值的確定 計算20份TTMV陰性血清OD450的平均值(x)為0.1116，標準差(SD)為0.0331，按照公式：x+3SD確定重組蛋白ELISA的陰陽性臨界值為0.211，即確定當用重組蛋白ELISA方法檢測時，OD450值>0.211可判斷為陽性，OD450值<0.211則為陰性(表8)。

表8 間接ELISA陰陽性臨界值的確定Table 8 Determination of the threshold for ELISA

2.2 特異性實驗 按建立的ELISA檢測方法對人TTV陽性血清、人HIV陽性血清和人星狀病毒（Astrovirus, AstV）陽性血清、人博卡病毒（Human Bocavirus, HBoV）陽性血清進行檢測，同時設TTMV陽性和TTMV陰性對照，可知其他4種病毒的陽性血清均為陰性反應，即沒有交叉反應（表9）。

表9 交叉試驗結(jié)果Table 9 Cross test result of indirect ELISA

2.3 重復實驗 用同批次純化重組抗原包被同一塊ELISA板，對3份陽性血清和1份陰性血清樣本進行檢測，重復3個孔，其變異系數(shù)在2.55%～5.88%之間，表明該方法具有較好的批內(nèi)重復性。用4塊不同時間包被的ELISA板，對包括已知陰、陽性血清在內(nèi)的4份樣品進行檢測，重復3個孔，其變異系數(shù)介于3.08%～7.47%之間，表明所建立的間接ELISA方法具有較好的重復性。

2.4 ELISA的初步應用 應用初步建立的ELISA檢測方法對上海同濟醫(yī)院124份門診病人血清樣品和遼寧錦州醫(yī)學院156份門診病人血清樣品進行檢測，檢測結(jié)果顯示，上海市124份血清樣本中檢測出陽性43例（34.68%），遼寧省156份血清樣本中陽性62例（39.74%）。

3 討論

ORF是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，不能被終止子打斷。TTMV 的ORF1由大約675個氨基酸組成，主要編碼TTMV核衣殼蛋白，并包含一些保守序列，TTMV核衣殼蛋白具有若干N 糖基化功能區(qū)，與TTV 和CAV 相似[11-12]。從2000年日本研究者首次報道了TTMV至今，不少研究學者都相繼報道了TTMV的流行病學調(diào)查結(jié)果。本試驗利用實驗室構(gòu)建并純化的重組蛋白TTMV-ORF1蛋白作為包被抗原，建立了檢測TTMV的間接ELISA檢測方法。

為了降低ELISA法的非特異性，首先以方陣滴定實驗調(diào)整好抗原最佳包被濃度為1.63 μg/mL，同時確定了血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:320。為了避免因反應時間過短而引起的結(jié)果誤差以及因反應過長影響檢測的敏感性和特異性, 本研究對反應中的各項條件進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，用含5%脫脂奶粉37℃ 1 h進行封閉，待檢血清37 ℃作用1 h, 酶標二抗37 ℃作用1 h, 底物TMB顯色液37 ℃作用10 min，ELISA結(jié)果最好且重復性較好。

此外，本研究根據(jù)統(tǒng)計學方法通過對20份陰性血清樣品進行ELISA檢測，確定臨界值為0.211后，對上海市124份血清樣本中檢測出陽性43例（34.68%），遼寧省156份血清樣本中陽性62例（39.74%）。本研究建立的間接ELISA檢測方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡單快速等特點，為TTMV的實驗室檢測及ELISA診斷試劑盒的制備提供了試驗依據(jù)，具有較好的應用前景。

[1] Takahashi K, Iwasa Y, Hijikata M,et al.Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus , TLMV)intermediately related to TT virus and chicken anemia virus[J].Arch Virol, 2000, 145(5) :979-993.

[2] Jones M S, Kapoor A, Lukashov V V,et al.New DNA viruses identified in patients with acute viral infection syndrome[J].J Virol, 2005, 79(13): 8230-8236.

[3] Harvery A.Relationship to Hepatitis Update on Viral Hepatitis postgraduate Course[J].Am Association Study Liver Dis, 2000: 68.

[4] Gallian P, Biagini P, Attoui H,et al.High genetic diversity revealed by the study of TLMV infection in french hemodialysis patients[J].J Med Virol, 2002, 67(4): 630-635.

[5] Moen E M, Huang L, Grinde B.Molecular epidemiology of TTV-like mini virus in Norway[J].Arch Virol, 2002,147(1): 181-185.

[6] Niel C, Lampe E.High detection rates of TTV-like mini virus sequences in sera from brazilian blood donors[J].J Med Virol, 2001, 65(1): 199-205.

[7] Thom K, Morrison C, Lewis J,et al.Distribution of TT virus (TTV), TTV-like minivirus, and related viruses, in humans and nonhuman primates[J].Virol, 2003, 306(2):324-333.

[8] Biagini P, Attoui H, Touinssi M,et al.Genetic analysis of Full-lengt h genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates[J].J Gen Virol, 2001,82(2): 379-383.

[9]陸承平.最新動物病毒分類簡介[J].中國病毒學, 2005,20(6): 682-688.

[10] Wellemans G.Laboratory diagnosis methods for bovine respiratory syncytial virus[J].Vet Sci Commun, 1977, 1:179-189.

[11] Biagini P, Attoui H, Touinssi M,et al.Genetic analysis of Full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates[J].J Gen Virol, 2001,82 (2): 379-383.

[12]何忠平.TTV 相關(guān)病毒的研究進展[J].臨床輸血與檢驗,2003, 5(2): 153-156.

[13] Fornai C, Maggi F, Vatteroni M L,et al.High prevalence of TT virus (TTV) and TTV-like mini virus in cervical swabs[J].J Clin Microbiol, 2001, 39: 2022-2024.

[14] Christian N, Elisabeth L.High detection rates of ttvlike mini virus sequences in sera from brazilian blood donors[J].J Med Virol, 2001, 65(1): 199-205.

[15] Matsubara H, Michitaka K, Horiike N,et al.Existence of TT virus DNA and TTV-like mini virus DNA in infant cord blood: mother-to-neonatal transmission[J].Hepatol Res, 2001, 21(3): 280-287.

[16] Moen E M, Sleboda J, Grinde B.Real-time PCR methods for independent quantitation of TTV and TTMV[J].J Virol Meth, 2002, 104(1): 59-67.

[17] Ninomiya M, Takahash M, Hoshino Y,et al.Analysis of the entire genomes of torque teno midi virus variants in chimpanzees: infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees[J].J Med Virol, 2009, 90(Pt2):347-358.

[18] Vasconcelos H C, Cataldo M, Niel C.Mixed infections of adults and children with multiple TTV-like mini virus isolates[J].J Med Virol, 2002, 68(2): 291-298.

[19] Philippe B.Human circoviruses[J].Vet Microbiol, 2004,98: 95-101.

[20] Moen E M, Sleboda J, Grinde B.Serum concentrations of TT virus and TT virus-like mini virus in patients developing AIDS[J].Aids, 2002, 16(12): 1679-1682.

[21] Philippe B, Pierre G, Jean F C,et al.Distribution and genetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groups in french blood donors[J].J Med Virol, 2006, 78(2):298-304.