耐力訓(xùn)練引起大鼠免疫機(jī)能低下及補(bǔ)充中藥多糖的干預(yù)效果研究

周麗麗 伊木清 王啟榮 高紅 許葆華 楊則宜

國(guó)家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京 100029）

長(zhǎng)期高強(qiáng)度訓(xùn)練增加運(yùn)動(dòng)員上呼吸道感染的危險(xiǎn)性，這與運(yùn)動(dòng)員免疫功能下降有關(guān)［1］。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能［2］，下丘腦室旁核（PVN）是下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸活動(dòng)的直接控制部位［3］，下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸激活引起的外周效應(yīng)為糖皮質(zhì)類固醇（主要為皮質(zhì)醇）分泌增加，這是機(jī)體主要的應(yīng)激反應(yīng)體系之一［4］，高濃度的糖皮質(zhì)激素可選擇性抑制細(xì)胞免疫功能［5，6］。運(yùn)動(dòng)可誘發(fā)機(jī)體多種細(xì)胞因子發(fā)生變化，許多細(xì)胞因子有激活HPA軸活動(dòng)的作用，IL-1、IL-6等對(duì)HPA軸有強(qiáng)興奮作用［4］。本研究采用流動(dòng)水池建立大鼠遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練模型，觀察6周耐力訓(xùn)練后大鼠血清和外周血單核細(xì)胞（PBMC）培養(yǎng)后上清液IL-1β含量變化、下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)和血清皮質(zhì)酮含量的變化，探討IL-1及其受體與HPA軸活化的可能關(guān)系和意義，同時(shí)選用牛膝多糖和黃芪多糖進(jìn)行干預(yù)，為改善耐力訓(xùn)練引起的免疫低下尋找干預(yù)措施。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

6周齡、體重110~130g的SPF/VAF級(jí)雄性Wistar大鼠48只（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)0043356），在清潔級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)近1周后，通過游泳能力篩檢篩選出40只大鼠，按體重隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、耐力訓(xùn)練組、訓(xùn)練+黃芪多糖組、訓(xùn)練+牛膝多糖組4組，每組10只。清潔級(jí)動(dòng)物房室內(nèi)溫度為20℃~26℃，濕度50% ~70%，晝夜節(jié)律用日光燈控制，每日光照時(shí)間12小時(shí)（早8點(diǎn)～晚8點(diǎn)），大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠最多5只，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 中藥多糖補(bǔ)充方案

黃芪多糖（APS）提取物（購(gòu)自浙江霍夫曼德公司）和牛膝多糖（APBS）提取物（購(gòu)自上海實(shí)久科技有限公司）用雙蒸水配制。從正式實(shí)驗(yàn)開始，每日上午訓(xùn)練開始前60分鐘對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃1次。訓(xùn)練+黃芪多糖組按2 g·kg-1劑量（相當(dāng)于黃芪多糖1 g·kg-1）灌服黃芪多糖提取物，訓(xùn)練+牛膝多糖組按1 g·kg-1劑量（相當(dāng)于牛膝多糖0.7·kg-1）灌服牛膝多糖提取物，安靜對(duì)照組和耐力訓(xùn)練組灌服等量安慰劑（雙蒸水）。

1.3 訓(xùn)練方案

安靜對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)，其他3組在流動(dòng)游泳水池中進(jìn)行訓(xùn)練。水深50~60 cm（約為大鼠體長(zhǎng)的1.5~2倍），水溫32±2℃，水流量4 m3/h。每天上、下午各訓(xùn)練1次，每周訓(xùn)練5天，共6周，訓(xùn)練時(shí)間由40 min/d逐漸增加到160 min/d，具體訓(xùn)練方案見表1。

表1 大鼠游泳訓(xùn)練方案（時(shí)間×次數(shù)）

1.4 取材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束36小時(shí)后取材。采用25%烏拉坦按0.5 m l·100g-1體重的劑量進(jìn)行腹腔麻醉，真空肝素鋰抗凝采血管腹主動(dòng)脈取血，用于外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離與培養(yǎng)，帶分離膠全血真空管制備血清后放于?80℃低溫冰箱，用于測(cè)定IL-1β、睪酮、皮質(zhì)醇。酒精消毒腹部后剖開腹腔，行左心室至主動(dòng)脈插管，經(jīng)4%多聚甲醛約150m l灌注固定后，取出腦組織，每組取3只大鼠腦組織測(cè)定下丘腦IL-1R。因測(cè)試試劑和采血量限制，部分指標(biāo)測(cè)試樣本數(shù)有所減少。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.5.1 血清指標(biāo)

采用ELISA方法測(cè)定血清IL-1β，試劑盒為美國(guó)Biosource公司產(chǎn)品。采用放射免疫分析法測(cè)定血清睪酮和皮質(zhì)酮，試劑盒均為美國(guó)DSL公司產(chǎn)品。

1.5.2 PBMC分泌IL-1β的測(cè)定

在超凈臺(tái)上按無菌操作分離PBMC細(xì)胞。分離方法及其無菌細(xì)胞懸液的制備方法見文獻(xiàn)［6］，最后用RPmi1640將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到2×106個(gè)細(xì)胞/m l。

在24孔板上每個(gè)樣品設(shè)2孔，每孔加細(xì)胞懸液1 m l，加入有絲分裂原 ConA（終濃度為 5 μg/m l），將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)后收獲培養(yǎng)上清液，2000 r/min離心10分鐘，上清移出置-80℃凍存，用ELISA方法測(cè)定上清液IL-1β（試劑盒為美國(guó)Biosource公司產(chǎn)品）。

1.5.3 下丘腦IL-1R表達(dá)測(cè)定

取腦組織放入30%蔗糖溶液浸泡，4℃過夜。經(jīng)干冰－正己烷（?70℃）驟冷，參照大鼠腦圖譜進(jìn)行下丘腦室旁核定位，做額狀面連續(xù)切片（20 μm），將4張切片裱于同一張玻片上。

腦組織Nissl染色：Nissl染液20分鐘，蒸餾水洗，50%酒精分色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封固。

腦組織免疫化學(xué)染色：冷凍切片經(jīng)冷風(fēng)吹干后，用PV-6001/6002二步法顯示下丘腦室旁核IL-1R。加入3%H2O2孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶；加入兔抗鼠多克隆抗體（1:100），37℃放置1 h，4℃冰箱過夜，第2日取出，室溫放置1 h，用0.01MPBS沖洗；滴加羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體（1:100），37℃，1 h，用0.01MPBS沖洗；加入DAB復(fù)合物顯色5~10分種，用0.01MPBS沖洗，蒸餾水終止反應(yīng)；50%、70%、80%、95%酒精脫水各5分鐘，100%酒精脫水5分鐘2次，二甲苯透明，樹膠封固。

光密度測(cè)定：免疫組織化學(xué)染色后，每組取3只動(dòng)物，每只動(dòng)物取2~3張片子，每張片子隨機(jī)取3個(gè)視野，在相同的光學(xué)和光源條件下，采用Leica公司Q550CW圖像分析系統(tǒng)采集圖像和Qw in圖像分析軟件分析測(cè)定觀察部位的平均光密度值（AOD）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS for Windows 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成，用One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，方差齊次性時(shí)，采用LSD法進(jìn)行多組之間比較；方差不齊次性時(shí)，用Tamhane’s T2法復(fù)選項(xiàng)進(jìn)行多組之間比較。統(tǒng)計(jì)數(shù)值用mean±SD表示，顯著性差異水平 α = 0.05。

2 結(jié)果

2.1 血清和PBMC培養(yǎng)后上清液IL-1β含量

表2顯示，耐力訓(xùn)練組血清IL-1β含量最高，與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異（P < 0.01）。2個(gè)補(bǔ)充組大鼠血清IL-1β顯著低于耐力訓(xùn)練組（P <0.05），而與安靜對(duì)照組水平接近（P > 0.05）。

耐力訓(xùn)練組大鼠PBMC培養(yǎng)后上清液IL-1β含量最高，與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異（P <0.01）。2個(gè)補(bǔ)充組PBMC生成IL-1β能力高于安靜對(duì)照組（分別高26.1%、21.3%），低于耐力訓(xùn)練組（分別低10.2%、13.6%），但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠血清和PBMC培養(yǎng)后上清液IL-1β含量比較

2.2 下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)

由表3可見，耐力訓(xùn)練組大鼠下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)最高，與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異（P< 0.05）。補(bǔ)充牛膝多糖組大鼠下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)與安靜對(duì)照組相同，顯著低于耐力訓(xùn)練組（P< 0.01）。補(bǔ)充黃芪多糖組高于安靜對(duì)照組，略低于耐力訓(xùn)練組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 血清皮質(zhì)酮和總睪酮含量

表4顯示，耐力訓(xùn)練組大鼠血清皮質(zhì)酮含量最高，與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異（P < 0.05）。補(bǔ)充牛膝多糖組血清皮質(zhì)酮與安靜對(duì)照組相同，但顯著低于耐力訓(xùn)練組（P < 0.01）；補(bǔ)充黃芪多糖組血清皮質(zhì)酮低于耐力訓(xùn)練組（低17.3%），高于安靜對(duì)照組（高26.5%）。

表3 各組大鼠下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)比較

耐力訓(xùn)練組大鼠血清總睪酮最低，與安靜對(duì)照組相比有顯著性差異（P < 0.05）。2個(gè)補(bǔ)充多糖組血清總睪酮分別高于耐力訓(xùn)練組54.3%和54.4%，低于安靜對(duì)照組21.4%和21.2%。

表4 各組大鼠血清睪酮和皮質(zhì)酮含量比較

3 討論

目前，關(guān)于高強(qiáng)度、長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)影響機(jī)體免疫功能的確切機(jī)制尚不清楚。高強(qiáng)度、長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是一種刺激，會(huì)引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)首先涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能，繼而出現(xiàn)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)機(jī)能的改變。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子不但是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，而且具有廣泛的中樞調(diào)節(jié)作用［7］。從細(xì)胞因子－神經(jīng)－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)角度探討訓(xùn)練對(duì)免疫功能的影響已經(jīng)引起一些學(xué)者的關(guān)注。

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，6周耐力訓(xùn)練可引起大鼠T細(xì)胞數(shù)量和功能變化，主要表現(xiàn)為活化的T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降、T細(xì)胞亞群中CD4+細(xì)胞數(shù)量下降及CD4+/CD8+比值下降、T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力降低等［8-10］，這些變化提示6周的耐力訓(xùn)練可引起大鼠細(xì)胞免疫功能下降。

研究顯示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能引起體液中細(xì)胞因子的改變［11，12］。一次運(yùn)動(dòng)或長(zhǎng)期訓(xùn)練均可使血漿或血清IL- 1水平或單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的能力顯著提高［13，14］。有學(xué)者提出，長(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于內(nèi)臟器官與運(yùn)動(dòng)器官之間血液重新分配，機(jī)體高代謝反應(yīng)以及其它未確定的原因，腸腔內(nèi)革蘭氏陰性菌的胞壁成份LPS穿過腸粘膜屏障移位進(jìn)入血液，運(yùn)動(dòng)者會(huì)出現(xiàn)類內(nèi)毒素血癥反應(yīng)。LPS進(jìn)入血液后可以刺激單核－巨噬細(xì)胞合成與分泌IL-1等細(xì)胞因子，推測(cè)這是運(yùn)動(dòng)后血漿IL-1等細(xì)胞因子濃度增加的一個(gè)主要原因［15］。同時(shí)IL-1被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)應(yīng)激刺激釋放的首批細(xì)胞因子之一［16］，被分類為促炎性細(xì)胞因子，通過與相應(yīng)高親和力受體IL-1R結(jié)合發(fā)揮作用，有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用，與機(jī)體免疫反應(yīng)有密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，6周耐力訓(xùn)練能引起大鼠血清IL-1β含量和PBMC生成IL-1β的能力提高，而訓(xùn)練同時(shí)補(bǔ)充黃芪多糖提取物或牛膝多糖提取物可防止血清中IL-1β含量明顯升高以及PBMC生成IL-1β過多的趨勢(shì)。

在生理情況下，腦內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞均具有合成IL-1的能力。外周血中少量IL-1可經(jīng)腦室周圍組織如正中隆起、終板血管器等進(jìn)人中樞神經(jīng)系［17］。IL-1有IL-1α和IL-1β兩種亞型，均須與IL-1R結(jié)合后才發(fā)揮作用。IL-1和IL-1R在中樞神經(jīng)系統(tǒng)定位于下丘腦和腦干等部位，下丘腦弓狀核、室旁核等均有IL-1β的免疫陽(yáng)性細(xì)胞，下丘腦、海馬、小腦、大腦皮質(zhì)等部位均有IL-1R及受體mRNA表達(dá)［18-20］。下丘腦室旁核是HPA軸活動(dòng)的直接控制部位［21，22］，IL-1對(duì)HPA軸主要是興奮作用，引起的外周效應(yīng)為糖皮質(zhì)類固醇（主要為皮質(zhì)醇）分泌增加，具體表現(xiàn)為IL-1作用于下丘腦神經(jīng)元，通過HPA軸引起促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）及其前體阿黑皮原mRNA表達(dá)，最終血漿糖皮質(zhì)激素（如皮質(zhì)酮）升高［4，7，23］。IL-1 還能抑制下丘腦－垂體－性腺軸功能（HPG），從而抑制促性腺激素誘導(dǎo)的睪酮分泌，表現(xiàn)為血液睪酮含量下降［24］，下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)升高將有利于IL-1發(fā)揮對(duì)HPA軸的激活和對(duì)HPG軸的抑制作用［4］。本研究結(jié)果顯示，6周耐力訓(xùn)練引起大鼠下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)升高，同時(shí)耐力訓(xùn)練大鼠血清中皮質(zhì)酮含量增加、總睪酮含量明顯下降，提示下丘腦IL-1R表達(dá)升高、血清中IL-1增高及血清皮質(zhì)酮升高、睪酮下降這些在耐力訓(xùn)練中的改變與IL-1及IL-1R對(duì)HPA軸的激活和對(duì)HPG軸的抑制作用表現(xiàn)的外周效應(yīng)一致。本實(shí)驗(yàn)關(guān)于2種中藥多糖的干預(yù)研究顯示，訓(xùn)練同時(shí)補(bǔ)充牛膝多糖或黃芪多糖有防止大鼠下丘腦室旁核IL-1R過多表達(dá)的作用，而且牛膝多糖較黃芪多糖更明顯。訓(xùn)練同時(shí)補(bǔ)充牛膝多糖或黃芪多糖有防止血清皮質(zhì)酮含量明顯升高、總睪酮含量顯著下降的趨勢(shì)。

4 總結(jié)

耐力訓(xùn)練引起細(xì)胞免疫功能下降可能與血清及PBMC中IL-1β升高和下丘腦室旁核IL-1R表達(dá)增加并激活HPA軸有關(guān)。訓(xùn)練補(bǔ)充牛膝多糖或黃芪多糖有防止血清IL-1β升高、降低大鼠下丘腦IL-1R表達(dá)過高的作用或趨勢(shì)，補(bǔ)充牛膝多糖、黃芪多糖的免疫保護(hù)作用可能與其防止HPA軸的過度激活有關(guān)。

［1］ Martin SA，Pence BD，Woods JA. Exercise and respiratory tract viral infections. Exerc Sport Sci Rev，2009，37（4）：157-164.

［2］Habib KE，Gold PW，Chrousos GP. Neuroendocrinology of stress. Endocrinol Metab Clin North Am，2001，30（3）：695-728.

［3］ 鄧旻，田國(guó)燕，史亦謙. 中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展. 醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36：26-28.

［4］ 楊權(quán). 下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸應(yīng)激反應(yīng)的中樞控制. 生理科學(xué)進(jìn)展，2000，31（3）：222-226.

［5］ 徐唯. 糖皮質(zhì)激素與免疫功能的關(guān)系及在運(yùn)動(dòng)免疫學(xué)中的作用. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（5）：954-957.

［6］Zen M，Canova M，Campana C，et al. The kaleidoscope of glucorticoid effects on immune system. Autoimmun Rev，2011 Jan 9.［ Epub ahead of print］

［7］ Ga dek-michalska A， Bugajski J. Interleukin-1（IL-1） in stress-induced activation of limbic-hypothalamic-pituitary adrenal axis. Pharmacol Rep，2010，62：969-982.

［8］ 周麗麗，王啟榮，伊木清，等. 中藥多糖對(duì)耐力訓(xùn)練大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群及活化T細(xì)胞數(shù)量的影響.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23：63-67.

［9］ 周麗麗，王啟榮，伊木清，等. 補(bǔ)充中藥多糖對(duì)耐力訓(xùn)練大鼠淋巴細(xì)胞免疫功能低下的預(yù)防作用. 天津體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20：18-25.

［10］周麗麗，王啟榮，伊木清，等. 耐力訓(xùn)練及補(bǔ)充中藥多糖對(duì)大鼠PBMC分泌細(xì)胞因子和血清中細(xì)胞因子含量的影響. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2006，22：1119-1123.

［11］ S uzukiK，Nakaji S，Yamada M，et al. Systemic inflammatory response to exhaustive exercise. Cytokine kinetics. Exerc Immunol Rev，2002，8：6-48.

［12］ S uzukiK，Nakaji S，Yamada M，et al. Impact of a competitive marathon race on systemic cytokine and neutrophil responses. Med Sci Sports Exerc，2003，35 ：348-55.

［13］Suzuki K，Nakaji S，Yamada M，et al. Systemic inflammatory response to exhaustive exercise. Cytokine kinetics. Exerc Immunol Rev，2002，8：6-48.

［14］Baum M，K l?pping-Menke K，Müller-Steinhardt M，et al. Increased concentrations of interleukin 1-beta in whole blood cultures supernatants after 12 weeks of moderate endurance exercise. Eur J Appl Physiol Occup Physiol，1999，79（6）：500-3.

［15］岳學(xué)狀，張?zhí)N琨，王雪梅. 運(yùn)動(dòng)與促炎性細(xì)胞因子.南京體育學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，1（2）：5-13.

［16］陳佩杰 . 運(yùn)動(dòng)免疫學(xué)研究進(jìn)展 . 體育科學(xué)，2000，20（6）：41-46.

［17］張國(guó)榮，張?jiān)氯A，吳希如. 白細(xì)胞介素-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用. 神經(jīng)科學(xué)，1997，4（1）：44-48.

［18］Friedman WJ. Cytokines regulate expression of the type I interleukin-1receptor in rat hippocampal neurons and glia.Exp Neurol，2001，168（1）：23-31.

［19］Sairanen TR，Lindsberg PJ，Brenner M，et al. Global forebrain ischemia results in differential cellular expression of interleukin-1beta and its receptor at mRNA and protein level. J Cereb Blood Flow Metab，1997，17（10）：1107-1120.

［20］劉國(guó)法，呂證寶，安林. 大鼠腦內(nèi)白細(xì)胞介素1I型受體mRNA的分布. 解剖學(xué)雜志，1999，22（1）：27-30.

［21］Habib KE，Gold PW，Chrousos GP. Neuroendocrinology of stress. Endocrinol Metab Clin North Am，2001，30（3）：695-728.

［22］Silverman MN，Pearce BD，Biron CA，et al. Immune modulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal（hpa）axis during viral infection. Viral Immunol，2005，18 ：41-78.

［23］ W ieczorekM，Dunn AJ. Relationships among the behavioral，noradrenergic，and pituitary-adrenal responses to interleukin-1 and the effects of indomethacin. Brain Behav Immun，2006，20（5）：477-487.

［24］Besedovsky HO and Rey AD. Immune-neuro-endocrine interactions：facts and hypotheses. Endocrine Reviews，1996，17（1）：64-102.