術(shù)后鼻黏膜組織嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白及趨化因子的變化

施祝良，張學(xué)淵，黃 潔

(本文編輯:潘雪飛; 英文編輯:王建東)

嗜酸性粒細(xì)胞的聚集、活化被認(rèn)為與鼻腔內(nèi)黏膜水腫、息肉形成密切相關(guān)。我們選擇慢性鼻-鼻竇炎不伴息肉(chronic sinusitis without nasal polyps，CRSsNP)患者術(shù)后黏膜轉(zhuǎn)歸過(guò)程為研究對(duì)象［1］。通過(guò)對(duì)手術(shù)患者鼻腔黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)動(dòng)態(tài)變化的研究，探討嗜酸性粒細(xì)胞聚集、活化與鼻內(nèi)鏡術(shù)前、術(shù)后鼻腔黏膜轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，為鼻內(nèi)鏡術(shù)后的治療提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病例分組及取材 選取2005年3月至6月我科收治的CRSsNP患者10例為研究對(duì)象，所有病例均于術(shù)前(術(shù)前組)、術(shù)后1～2周(術(shù)后A組)、術(shù)后4～6周(術(shù)后B組)及術(shù)后10～12周(術(shù)后C組)取上頜竇口周邊水腫的鼻黏膜組織進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組為10例同期鼻中隔偏曲或單純上頜竇囊腫患者的中鼻甲黏膜(含有少量嗜酸性粒細(xì)胞的鼻腔黏膜)。上述標(biāo)本離體后迅速于液氮中保存?zhèn)溆?。鼻?nèi)鏡術(shù)前停用鼻噴激素1周，術(shù)中處理泡狀中鼻甲、嚴(yán)重鼻中隔偏曲等明顯的局部病變，通暢鼻竇引流，手術(shù)前后合理使用抗生素，不使用鼻噴激素。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Immulite化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑購(gòu)自美國(guó)DPC公司；大鼠抗人eotaxin多克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠的二抗為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RIPA蛋白提取試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 鼻黏膜組織的裂解及組織總蛋白的測(cè)定采用文獻(xiàn)［2］方法測(cè)定。

1.3.2 鼻黏膜組織中ECP的表達(dá) 采用文獻(xiàn)［2］方法測(cè)定。

1.3.3 鼻黏膜eotaxin的表達(dá) 用Western-blot檢測(cè)。取上述方法提取的組織上清液用N-3(羥甲基)甲基甘氨酸-甘氨酸系統(tǒng)電泳，電轉(zhuǎn)移至0.22 μm硝酸纖維素膜，該膜經(jīng)含1%牛血清的三羥甲基氨基甲烷生理鹽水緩沖液(50 mmol pH 7.5)振搖2 h，于4℃封閉過(guò)夜后，與大鼠抗人eotaxin多克隆抗體(稀釋度1∶500)在4℃下孵育過(guò)夜，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠的二抗(稀釋度1∶500)室溫下孵育90 min，最后經(jīng)ECL發(fā)光試劑盒顯影，X線膠片記錄結(jié)果，用quantity one Version 4.4軟件測(cè)定蛋白條帶的積分密度(IOD)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.0對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)行單因素方差分析，SNK法兩兩比較，兩組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)；并行直線相關(guān)性分析；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

ECP及eotaxin鼻內(nèi)鏡術(shù)后隨時(shí)間呈現(xiàn)如下變化規(guī)律：①術(shù)后1～2周較術(shù)前病變黏膜組明顯降低；②術(shù)后4～6周達(dá)高峰，基本恢復(fù)至術(shù)前水平；③術(shù)后10～12周回落，接近于術(shù)后1～2周水平。④手術(shù)前后鼻腔黏膜ECP及eotaxin的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)γ=0.719，P=0.004。見(jiàn)表1。

3 討論

鼻內(nèi)鏡術(shù)后黏膜上皮化是一個(gè)動(dòng)態(tài)而較長(zhǎng)之過(guò)程，約需3～6個(gè)月時(shí)間，期間會(huì)出現(xiàn)鼻腔黏膜水腫、囊泡、小息肉，有部分患者不能完成黏膜上皮化，鼻竇炎再次發(fā)作；其機(jī)制不太明晰，與此相關(guān)的細(xì)胞因子研究文獻(xiàn)不多［3］。本研究通過(guò)對(duì)鼻內(nèi)鏡手術(shù)前后不同時(shí)期鼻黏膜組織中和ECP和eotaxin表達(dá)的測(cè)定，試圖從分子水平探討嗜酸性粒細(xì)胞聚集活化對(duì)鼻內(nèi)鏡術(shù)后鼻腔黏膜上皮化的影響，為鼻內(nèi)鏡術(shù)后的治療提供一定的理論依據(jù)。

表1 手術(shù)前后鼻黏膜組織中ECP及eotaxin含量的變化()

表1 手術(shù)前后鼻黏膜組織中ECP及eotaxin含量的變化()

注：*為ECP含量與組織總蛋白的含量之比/10-6。與術(shù)前組比較，#P＜0.05；與術(shù)后C組比較，▲P＞0.05

ECP含量代表嗜酸性粒細(xì)胞的活性［2，4］。其生物活性主要表現(xiàn)在細(xì)胞毒性和非細(xì)胞活性兩方面。細(xì)胞毒性表現(xiàn)為ECP對(duì)細(xì)胞膜具有破壞作用，在被攻擊的細(xì)胞膜上形成小孔，使水分子等小分子物質(zhì)可自由通過(guò)，細(xì)胞因滲透壓下降腫脹壞死；非細(xì)胞活性在呼吸道炎癥中主要表現(xiàn)為刺激嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺、呼吸道黏液分泌增加。eotaxin被認(rèn)為是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一能有效選擇性激活嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子，也被認(rèn)為對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞趨化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一［5］。eotaxin在鼻腔黏膜中增多時(shí)，表明局部嗜酸性粒細(xì)胞增多，并被激活，活化的嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒，ECP分泌也隨之增加；ECP的攻膜作用使更多的嗜酸性粒細(xì)胞溶解，嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)的eotaxin釋放，因而ECP及eotaxin在鼻黏膜病變中具有相互促進(jìn)作用［6-7］。

本實(shí)驗(yàn)提示，術(shù)后初期鼻腔黏膜ECP及eotaxin的表達(dá)較術(shù)前明顯降低，可能是因?yàn)閯偸中g(shù)后鼻腔內(nèi)病變黏膜及其所包含的炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子明顯減少；另外，鼻內(nèi)鏡手術(shù)是一個(gè)創(chuàng)傷，術(shù)后患者應(yīng)激性腎上腺皮質(zhì)激素升高，抑制鼻腔嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的發(fā)展和細(xì)胞因子的表達(dá)。術(shù)后4～6周ECP及eotaxin的表達(dá)明顯高于術(shù)后10～12周組。表明此期鼻腔黏膜中有較多的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且其活性較高。嗜酸性粒細(xì)胞被激活后分泌細(xì)胞因子增加，由于當(dāng)時(shí)鼻腔黏膜尚未完成上皮化，纖毛功能恢復(fù)不全，不能形成“黏液毯”［8］，包括 eotaxin在內(nèi)的細(xì)胞因子不能及時(shí)帶走，進(jìn)而募集并激活以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞，這些炎性細(xì)胞又分泌各類(lèi)細(xì)胞因子，形成“自我放大”，所以eotaxin表達(dá)較多，手術(shù)區(qū)黏膜水腫明顯，部分呈息肉樣變［9］。術(shù)后2～3個(gè)月，鼻腔局部炎癥消退，大部分患者鼻腔黏膜逐步完成上皮化。

本實(shí)驗(yàn)提示，鼻內(nèi)鏡術(shù)后鼻腔黏膜中 ECP、eotaxin的表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，與鼻腔黏膜的修復(fù)轉(zhuǎn)歸過(guò)程相對(duì)應(yīng)；在臨床上，應(yīng)該加強(qiáng)這段時(shí)期的治療(換藥、沖洗、局部用藥)，以利盡早完成術(shù)后鼻腔黏膜組織的修復(fù)［10］。

［1］中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)分會(huì)鼻科學(xué)組.慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南［J］.中國(guó)臨床醫(yī)生，2010，38(4)：73-74.

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